摘要: 山西老陈醋具有悠久的酿造历史和独特的酿造工艺。在开放式固态酿造过程中微生物群落不断演替，完成物质的分解、转化以及有机酸等风味物质的合成。微生物群落及其代谢是山西老陈醋酿造的本质。但目前这一复杂生态体系中微生物群落间的相互作用及其代... 展开 山西老陈醋具有悠久的酿造历史和独特的酿造工艺。在开放式固态酿造过程中微生物群落不断演替，完成物质的分解、转化以及有机酸等风味物质的合成。微生物群落及其代谢是山西老陈醋酿造的本质。但目前这一复杂生态体系中微生物群落间的相互作用及其代谢调控机制仍不清晰，对传统食醋酿造机理的理解仍不深入，限制了行业科技水平的提升。本论文采用宏组学（自上而下）方法对山西老陈醋发酵过程微生物群落组成及其代谢网络动态变化进行了系统分析，采用模拟固态发酵（自下而上）方法对主要微生物功能进行了验证，进一步提出了山西老陈醋群落相互作用及有机酸代谢调控机制。 经宏基因组学和宏转录组学技术对山西老陈醋发酵过程微生物进行检测分析表明，醋醅中属水平上主要微生物为乳杆菌属、醋杆菌属和链球菌属，种水平上以耐酸乳杆菌、巴氏醋杆菌和瑞士乳杆菌为主。通过对宏转录组挖掘分析，构建了山西老陈醋醋酸发酵过程微生物共现网络。结果表明，乳杆菌属、醋杆菌属和片球菌属具有最高的相关性系数，是维持山西老陈醋发酵生态系统稳定性最关键的功能微生物。醋醅微生物群落代谢网络表明，代谢活动最丰富的三种微生物是干酪乳杆菌、异常威克汉姆酵母和戊糖乳杆菌；最常见的三种底物是葡萄糖、果糖和麦芽糖；出现频率最高的三种代谢产物是乳酸、乙酸和乙醇。进一步，利用数学计算模型对微生物之间相互作用影响进行评估，构建了关键微生物影响网络，发现山西老陈醋生态系统中微生物间普遍存在竞争作用，戊糖乳杆菌是具有显著代谢影响力的关键物种，乳酸、乙酸、乙醇、2,3-丁二酮、丁酸和丙酸是微生物代谢交互作用中的潜在调控物质。 通过对差异表达基因在CAZy和KEGG数据库中的分布分析表明，山西老陈醋发酵前中期和中后期，分别有397个（上调223个，下调174个）和1468个（上调518，下调950个）差异显著基因在CAZy中富集，主要集中于GT家族和GH家族；分别有1080个（上调618个，下调462个）和3418个（上调1239个，下调2179）差异显著基因在KEGG代谢途径中富集，以碳水化合物代谢、核苷酸代谢、能量代谢和氨基酸代谢为主。随着发酵的进行，微生物对纤维素和淀粉的降解作用逐渐减弱，且微生物在发酵中后期的代谢活动较发酵前中期的变化更为剧烈。 通过对KEGGAPI接口解析及信息提取，实现了山西老陈醋发酵过程微生物基因组尺度代谢途径的可视化。分析表明，发酵过程中微生物参与了KEGG全局代谢途径（map01100）的所有代谢子网络，且在发酵前期和中期，功能基因的表达水平整体趋近均衡。而发酵后期大部分功能基因的表达水平明显降低，少部分途径反而更加活跃。发酵过程中存在的丰富的与碳水化合物转运系统相关的酶系多数在后期出现下调；能量代谢中以氮代谢途径和氧化磷酸化途径最为活跃，特别是在发酵中后期；氨基酸代谢在发酵后期更为活跃，尤其是丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（ko00250）和甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢（ko00260）。进一步对差异基因富集途径中的微生物分布分析表明，参与代谢的微生物多样化特征显著，但均以乳杆菌属和醋杆菌属为主，且存在由乳杆菌属占据主导地位到醋杆菌属出现并与乳杆菌属共同发挥作用的演替现象。 有机酸是食醋中最重要的风味物质，因此重点从宏组学数据中提取与有机酸代谢相关信息并构建了山西老陈醋中主要有机酸（滋味活性值大于1）的代谢网络。分析表明，山西老陈醋中参与乙酸形成的酶系最丰富（11个），其次是苹果酸（6个）和琥珀酸（5个），且有机酸合成酶系主要来源于醋杆菌属和乳杆菌属。而且，有机酸来源微生物和代谢途径随着发酵的进行而不断演替。发酵第1天和第3天，乙酸和乳酸的代谢分别主要通过乳杆菌属的乙酰磷酸途径和丙酮酸途径，此后则分别转变为醋杆菌属的乙醛途径和L-乳醛途径。 通过对有机酸来源微生物的代谢活性进行验证表明，温度和乙酸是山西老陈醋中有机酸代谢调控的主要环境因子。采用模拟固态发酵对调控机制进行进一步解析，将巴氏醋杆菌耐酸基因grpE在具有耐温特性的乳酸片球菌AAF1-5中重组表达，并用于食醋模拟固态发酵。发酵结束时，P.acidilactici-grpE添加组中的乳酸含量为2.25g/100g醋醅，比对照P.acidilactici添加组提高了23.63%，比空白组提高了37.20%。乳酸/乙酸比对照组提高了47.37%，比空白组提高了30.23%。结果证实，主要功能微生物醋酸菌和乳酸菌的耐温性、耐酸性是山西老陈醋发酵过程乙酸和乳酸代谢的调控机制之一。 收起