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国家工程技术图书馆
2022年11月29日
摘要: 目的:为了研究胃癌血清外泌体内差异表达的环状RNA,通过环状RNA芯片检测发现新的circRNA分子——hsa_circ_0129290(circ0129290),阐明circ0129290在胃癌血清及其外泌体中的表达变化、胃癌中的生物学作用及具体分子机制,以期为胃癌诊断及预后判断提... 展开 目的:为了研究胃癌血清外泌体内差异表达的环状RNA,通过环状RNA芯片检测发现新的circRNA分子——hsa_circ_0129290(circ0129290),阐明circ0129290在胃癌血清及其外泌体中的表达变化、胃癌中的生物学作用及具体分子机制,以期为胃癌诊断及预后判断提供新的分子标志物以及潜在的治疗靶点。 方法:提取三对胃癌患者/健康人血清外泌体,利用博奥晶典人类环状RNA芯片V2表达谱芯片检测,筛选出差异表达的目标分子circ0129290。收集胃癌患者及健康人血清及外泌体,采用qRT-PCR(Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)检测分析circ0129290的表达水平,ROC曲线分析诊断效能。FISH(Fluorescence in situ hybridization)实验和核质分离(Nuclear-cytoplasmic separation assay)确定circ0129290的亚细胞定位,RNase R和Actinomycin D处理后检测其稳定性。通过siRNA和过表达质粒转染在胃癌细胞中分别敲减和过表达circ0129290,检测细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭、等生物学功能变化。利用生物信息学技术预测与circ0129290结合的miRNA及其调控靶基因,并通过荧光素酶报告基因检测、RIP(RNA binding proteins immunoprecipitation)、FISH实验进行验证。Western blot、qRT-PCR及免疫组织化学实验(Immuno-histochemistry)进一步用于验证miRNA的靶基因及下游通路检测。同时,过表达circ0129290慢病毒转染的细胞,超速离心法提取外泌体,与AGS细胞进行共培养,进行一系列功能学实验,包括CCK8实验、细胞克隆实验、迁移侵袭实验和细胞周期实验。 结果:环状RNA circ0129290在胃癌患者血清及血清外泌体显著高表达(plt;0.0001),与肿瘤大小(p=0.003)、血管侵袭(p=0.001)有关,ROC曲线分析血清外泌体circ0129290诊断效能(面积为0.6998)。Circ0129290主要表达于细胞质中,能抵抗RNase R和Actinomycin D作用,其稳定性显著高于线性RNA。敲减circ0129290抑制细胞迁移侵袭、增殖、克隆形成,并且促进细胞凋亡。过表达circ0129290则相反。生物信息学分析显示circ0129290具有多种miRNA结合位点,且能与AGO2蛋白免疫共沉淀。双荧光素酶报告基因检测结果显示miR-4436b-5p能显著抑制circ0129290野生型载体3’UTR区域荧光素酶活性,并且具有抑癌作用,与circ0129290共转后逆转circ0129290的促癌作用。PELI2(Pellino-2)被证明是miR-4436b-5p的靶基因,在胃癌组织中高表达,并且通过调控IRAK1的泛素化,影响下游JNK通路的磷酸化水平,故Circ0129290通过miR-4436b-5p/PELI2/JNK轴发挥促癌作用。同时circ0129290被实验证明可以包裹在外泌体中,参与胃癌细胞间的交流。 结论:血清外泌体circ0129290在胃癌中具有一定的临床价值,可能是胃癌诊断潜在的新分子标志物。Circ0129290可通过miR-4436b-5p/PELI2/JNK轴发挥促癌作用,并且可以被包裹在外泌体中参与胃癌细胞间的交流,促进胃癌的进展。 收起
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