摘要: 研究背景; 阿尔茨海默病(Alzheimer''sdisease，AD)是神经内科疾病中一种多发的具有进展性的神经系统退行性病变，该病多发生在老年群体中，对人类的健康造成极大的危害，通常表现为一系列的临床综合症候群，以认知变化为主要表现，且遵循一定的模... 展开 研究背景; 阿尔茨海默病(Alzheimer''sdisease，AD)是神经内科疾病中一种多发的具有进展性的神经系统退行性病变，该病多发生在老年群体中，对人类的健康造成极大的危害，通常表现为一系列的临床综合症候群，以认知变化为主要表现，且遵循一定的模式，往往从记忆障碍开始，逐渐扩散至语言和视觉空间障碍，甚至出现人格行为改变的临床症状等。AD最明显的相关因素是高龄和阳性家族史，据统计，在超过85岁的高龄群体中，其发病率可高达20％-40％，伴随物质生活条件改善和医疗技术的提高，平均人口寿命较前明显延长，老年群体的比例显著增加，AD的罹患率和发病人数也不断地呈上升趋势。AD严重影响老年人的生命健康并降低生存质量，已跃居成为三类最重要的致死性疾病之一，仅排在心脑血管疾病和恶性肿瘤之后。在病理研究中发现，最早和最严重的变性一般出现在颞叶内侧、外侧颞叶皮质和迈内尔特(Meynert)基底核，由脑内β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积而成的神经炎斑或者叫做老年斑(SP)以及在病理状态下被过度磷酸化的Tau蛋白形成的神经原纤维缠结是AD的核心病理改变。尽管对AD的研究探索已有百年之久，其病因和发病机制仍未十分明确，治疗亦无特效疗法，在药物治疗的研究中，除了可以部分的提高认知功能外，其他针对AD的药物试验均未取得明显突破。当前研究AD的切入点就在于找到确切的可以阻止或遏制AD发病以及进展的治疗靶点。 很多学者已经证实，存在于中枢神经系统(CentralNervousSystem，CNS)中的典型的AD病理改变，在外周神经系统(peripheralnervoussystem，PNS)也同样存在，尤其是在被称作“第二大脑”的肠神经系统(EntericNervousSystem，ENS)。尽管在100多年前学者们已经认识到ENS的结构和细胞形态，但由于缺乏相应的研究方法和技术，甚至是重视程度不足，对ENS神经元和神经通路的功能研究起步较晚。ENS的一个重要特点就体现在肠神经元细胞类型的复杂性和多样性，在肠道系统的神经丛中的复杂传导结构主要包括肠神经元和肠神经胶质细胞结构。由不同肠神经元合成的特定信息传导物质发挥着肠道功能调节作用。有趣的是，ENS的功能和化学多样性与CNS非常相似，包括神经递质、信号通路和解剖特性，但目前尚不明确ENS中是否存在与CNS相似的病理特征。 肾脑表达蛋白也被一些学者称为肾脑蛋白(Kidneyandbrainexpressedprotein，KIBRA)，是一种以WW结构域为主的支架蛋白。KIBRA在大脑皮层、海马和肾脏中高表达已被证实，随着基因组分析的深入，近年来发现KIBRA基因多态性与我们的记忆和认知功能有关。而记忆及认知功能障碍是AD患者的突出症状，从而有学者提出KIBRA蛋白参与了AD的病理过程，同时近期有相关研究进一步发现在Aβ诱导神经元凋亡的过程中KIBRA发挥了重要作用。KIBRA被称为记忆相关基因，其参与记忆功能的通路是由α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(α-Amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionicacid，AMPA)受体和蛋白激酶Mζ(ProteinkinaseMζ，PKMζ)共同调节介导的。在肾脏和记忆相关的中枢神经系统神经元细胞内可以发现KIBRA存在特异性表达，而在ENS中是否同样存在尚不清楚。在经过相关人员的研究分析之后，最终发现AD患者的肠道神经系统和大脑组织中，均存在Aβ斑块和神经元纤维缠结两种物质，异常沉积的Aβ斑块和神经元纤维缠结可导致线粒体功能障碍、肠道分泌和运动模式改变、神经元活化异常等一系列变化，从而导致了肠道神经功能障碍的发生。基于以上已知机制，我们将着重研究KIBRA在AD小鼠肠神经系统中的病理改变及相关机制。 研究目的: 1、研究APP/PS1转基因小鼠肠神经系统的病理变化特征; 2、明确KIBRA在APP/PS1转基因小鼠肠神经元的特定表达规律及探索其机制。 研究方法: 1、动物模型:在所有研究AD所使用的的动物模型中，APP/PS1转基因小鼠是研究使用较广的动物，购自南京动物模式中心，使其作为实验组，在进行研究时，采用同一窝的野生型小鼠作为对照组，将其选择合适的温度进行饲养，分别将两组小鼠放置在光照和黑暗交替的环境中，时间统一为12小时。他们可以自由的摄取食物和水。 2、行为学检测:采用Morris水迷宫检测，进行定位巡航实验和空间探索实验，观察两组小鼠在认知功能方面的变化。以上的实验结果使用Smart3.0软件的录像跟踪系统来记录、分析。 3、免疫组织染色:组织需要经过固定、脱水、包埋等步骤完成以后再进行切片和染色处理，应用DAB体系显色。免疫荧光染色，应用AlexaFluor荧光二抗进行荧光染色。检测Aβ、P-tau、Tau、nNOS、ChAT、Tuj1、HuC/D、CD68、GAD67、KIBRA。用ImageJ图像处理软件进行每种染色图片的图像分析。 4、整体组织免疫染色:第一步将肠粘膜及粘膜下层从肠道肌层组织上分离下来，再将肠粘膜及其下层组织剥离开，然后将肌层组织中的环肌层及纵肌层剥离开，在整个过程中不要损伤肌间神经的同时使其尽量的附着在纵肌层内表面。标本浸泡、固定、脱水、水化等处理后，步骤同免疫荧光染色。 5、免疫蛋白印迹:RIPA缓冲液提取组织及细胞中的蛋白，电泳跑胶，然后转膜，一抗孵育。对APP/PS1转基因小鼠肠道神经系统中的Aβ、P-tau、KIBRA、Tuj1的表达进行检测;对免疫蛋白印迹的结果采用ImageJ软件进行分析处理。 6、统计学分析:我们采用GraphPadPrism5对所有的实验数据进行统计分析，采用均数±标准（(X)±S）对定量数据进行表示，组间比较采用的是独立样本t检验。以p＜0.05为具有统计学意义。 研究结果: 1、AD小鼠模型验证 在对AD模型小鼠进行检测的过程中，可以明显看出实验组转基因小鼠同对照组的小鼠两相对比之下，其逃跑的时间更长，同时观察到实验组转基因小鼠，跨平台的次数却明显减少，这在很大程度上证明了，在空间学习能力及记忆功能方面12月龄转基因小鼠有了明显降低，且经过Aβ免疫组织化学染色方法之后，发现该组小鼠的脑内的皮层及海马区沉积了大量的Aβ斑块。 2、APP/PS1小鼠回肠及空肠中Aβ的沉积和P-tau的过表达 为了研究AD小鼠ENS的病理变化特征，我们采用一种新的整体组织免疫染色法，提取12月龄的APP/PS1小鼠回肠和空肠，然后我们采用免疫荧光染色方法来对实验组APP/PS1转基因小鼠回肠和空肠组织中Aβ和P-tau的含量进行检测。与WT组进行比较，实验组APP/PS1转基因小鼠的回肠在粘膜下神经丛和肌间神经丛中Aβ阳性神经元的数量明显多于WT小鼠。此外，Aβ的沉积和P-tau(181)的过度表达通过蛋白质印迹进一步验证。 运用同样的方法来对空肠组织进行检测，我们观察到同对照组相比，实验组APP/PS1转基因小鼠表达Aβ的神经元比例（Aβ和Tuj1双阳性细胞）明显增高。同时，T-tau和P-tau的免疫荧光染色显示，实验组APP/PS1转基因小鼠空肠中T-tau和P-tau的沉积比对照组野生型小鼠空肠中T-tau和P-tau的沉积数量明显增加，而且大部分Tau蛋白定位在神经元中。表明脑的AD特异性病理特征也发生在ENS网络中。 3、APP/PS1小鼠回肠中特定神经元亚型损伤的特征 通过对12月龄的转基因小鼠ENS的神经元变化进行检测，来详细说明APP/PS1小鼠回肠神经元损伤情况。在对照组野生型小鼠和实验组12月龄APP/PS1转基因小鼠进行研究分析时，我们采取Tuj1免疫染色的方法，了解在回肠深肌丛、肌肠丛和粘膜下神经丛中，Tuj1染色面积占对照组小鼠和转基因小鼠回肠总面积的具体比值，在经过了一系列的研究分析之后，得出对照组WT小鼠和12月龄转基因小鼠回肠的Tuj1染色面积的差异不具有统计学意义。此外，我们也观察到HuC/D阳性的肌间神经元的数目在两组中也无差异(p=0.06)。上述情况均说明，12月龄转基因小鼠回肠中总的神经网络，没有受到任何的影响。 而在WT和APP/PS1小鼠回肠中进行氮能神经元标记物-nNOS和-胆碱能神经元标记物-ChAT的免疫染色。与对照组野生型小鼠相比，这两种神经元亚型在实验组APP/PS1转基因小鼠的肌间神经丛中均表现出下降的趋势。 4、CD68+巨噬细胞在APP/PS1小鼠回肠中的聚集 整体组织染色技术用来检测了CD68+在回肠肌间组织中的表达，结果表明，实验组小鼠回肠CD68+巨噬细胞数量显著高于对照组野生型小鼠(p=0.0003)。除肌层巨噬细胞外，主要存在于肠粘膜固有层的巨噬细胞通过与肠粘膜下层神经元相互作用来维持胃肠内环境的稳定。为了精确显示固有层巨噬细胞的数量，我们使用免疫组织化学染色方法，发现与对照组野生型小鼠相比，实验组APP/PS1转基因小鼠CD68+的固有层巨噬细胞数量明显增加(p＜0.0001)。这些结果提示，Aβ的沉积和P-tau的过表达可能诱导APP/PS1小鼠中CD68+巨噬细胞的聚集。 5、APP/PS1小鼠空肠肌间神经丛KIBRA水平显著升高 分别对实验组的12月龄的APP/PS1小鼠和对照组的野生型小鼠的肠道系统进行了KIBRA和神经元标志物Tuj1的整体染色。结果表明，KIBRA阳性神经元在APP/PS1小鼠空肠肌间神经丛的比例明显高于其在野生型对照组中的比例(p=0.0279)。此外，肌肉层的Westernblotting分析证实了KIBRA在实验组APP/PS1小鼠中的过度表达，而实验组APP/PS1小鼠和对照组小鼠在Tuj1的表达水平方面并没有差异。提示KIBRA在实验组APP/PS1小鼠空肠肌间神经丛中的表达水平上调。 6、KIBRA在APP/PS1小鼠空肠肌间神经丛和大脑皮层GABA能神经元水平升高 30多种功能不相同的神经元存在于哺乳类动物的肠道神经系统中，它们通过作用不相同的神经递质来进行信息传递，其中包括γ氨基丁酸能神经元、胆碱能神经元、氮能神经元。采用免疫荧光共染色的方法来进一步评估KIBRA在实验组小鼠空肠肌间神经丛神经元亚型中的表达。结果表明，GAD67+神经元中KIBRA在实验组小鼠空肠肌间神经丛的表达显著高于其在对照组小鼠中的表达(p=0.0492)，而空肠肌间神经丛胆碱能(ChAT+)和氮能(nNOS+)神经元KIBRA的表达水平与野生型小鼠无明显差异。有趣的是，KIBRA在大脑皮层的GABA能神经元中也显示上调，提示KIBRA在神经系统中起到重要作用。 结论: 1、在实验组APP/PS1小鼠肠神经系统中存在Aβ沉积和P-tau的过表达等AD的典型病理改变。 2、APP/PS1小鼠肠神经系统中的整个神经网络并未受损，主要是功能神经元亚群（氮能和胆碱能神经元）受损，Aβ沉积和P-tau的过表达可能诱导实验组APP/PS1转基因小鼠中CD68+巨噬细胞的聚集。 3、KIBRA在APP/PS1小鼠肠神经元的特异性表达:KIBRA蛋白在实验组APP/PS1转基因小鼠空肠肌间神经丛中表达上调。KIBRA的表达上调主要位于空肠肌间神经丛GAD67+神经元中，而非胆碱能(ChAT+)和氮能(nNOS+)神经元，并且大脑皮层的GABA能神经元也显示KIBRA的上调，提示KIBRA在神经系统中的关键功能，这些发现将为探索AD治疗药物，可能提供一个非常具有潜力的作用靶点。 收起