摘要:
内参基因通常在各种细胞和组织中稳定表达。然而，据报道某些内参基因的表达在不同物种中可能是不同的。本研究基于转录组分子生物学分析、RT-PCR检测、荧光定量PCR检测以及内参基因稳定性评价软件分析，探究多倍体鱼中报道的一些传统内参基因的表达是...
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内参基因通常在各种细胞和组织中稳定表达。然而，据报道某些内参基因的表达在不同物种中可能是不同的。本研究基于转录组分子生物学分析、RT-PCR检测、荧光定量PCR检测以及内参基因稳定性评价软件分析，探究多倍体鱼中报道的一些传统内参基因的表达是否发生变化，并为多倍体鱼筛选出合适的内参基因。主要结果如下： 1、通过文献阅读，确定了12个常用内参基因（RPS5,RPS18,RPL7,RPLP2,RPL13α,EF1-α,DDX5,β-actin,β-tubulin,hprt1,B2M,GAPDH）作为本研究的候选内参基因并调取多倍体鱼肝脏组织转录组数据（二倍体红鲫、三倍体湘云鲫、异源四倍体鲫鲤）和多倍体鱼细胞转录组数据（二倍体红鲫尾鳍细胞、异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞、SP4N细胞）。通过分析多倍体鱼肝脏组织转录组数据，发现RPL7,RPL13α,GAPDH在异源四倍体鲫鲤与二倍体红鲫之间呈现差异表达（/log2FC/＞1.5且p-value＜0.05);RPS5,EF1-α在异源四倍体鲫鲤与二倍体红鲫之间p-value＜0.05；RPLP2在异源四倍体鲫鲤与二倍体红鲫之间/log2FC/＞1.5；β-actin在三倍体湘云鲫与二倍体红鲫之间/log2FC/＞1.5;B2M在三倍体湘云鲫与二倍体红鲫之间p-value＜0.05。通过分析多倍体鱼细胞转录组数据，发现RPS18,RPLP2,RPL13α,B2M在异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞与二倍体尾鳍细胞之间p-value＜0.05；RPL13α,B2M在SP4N细胞与二倍体尾鳍细胞之间p-value＜0.05。因此，转录组数据表明这些传统的内参基因在多倍体鱼中存在不稳定的现象。 2、多倍体鱼肝脏组织转录组数据和多倍体鱼细胞转录组数据表明传统的内参基因在多倍体鱼中存在不稳定现象，进一步以3种不同倍性鱼（二倍体红鲫、三倍体湘云鲫、异源四倍体鲫鲤）的10种不同组织和4种不同倍性鱼类细胞系（二倍体红鲫尾鳍细胞、三倍体湘云鲫尾鳍细胞、异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞、SP600125诱导的鲫细胞系(SP4N)）为材料进行RT-PCR。结果显示，在多倍体鱼组织中，12个候选内参基因中除RPS5,RPS18,β-actin在不同样本中均有不同程度的表达外，其他候选基因均存在一个或多个组织中无明显阳性条带。在多倍体鱼细胞中，RPS18,β-actin在四种多倍体鱼细胞中呈现非常强烈的表达，RPS5,RPL13α,RPL7,EF1-α,DDX5,β-tubulin在四种多倍体鱼细胞中的表达情况相对较高，而RPLP2,hprt1,B2M,GAPDH在一种或两种细胞中低表达。RT-PCR实验表明多倍体鱼中确实存在常用内参基因不稳定现象。 3、为了建立用于多倍体鱼基因表达研究的最佳内参基因，利用荧光定量PCR技术进一步检测了12个候选内参基因在三种鱼（二倍体红鲫、三倍体湘云鲫、异源四倍体鲫鲤）的10种组织和四种不同倍性鱼类细胞系（二倍体红鲫尾鳍细胞、三倍体湘云鲫尾鳍细胞、异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞、SP4N细胞）中的表达情况以及评估候选内参基因的稳定性。在多倍体鱼组织中，RPS5,RPS18,RPL7的Ct值变化范围比较小，B2M和GAPDH的Ct值变化范围较大，初步说明在多倍体鱼组织中RPS5,RPS18,RPL7表达相对稳定。在多倍体鱼细胞中，RPS5,RPS18,EF1-α的Ct值变化范围较小，而B2M和GAPDH的Ct值变化范围较大，初步说明在多倍体鱼细胞中RPS5,RPS18,EF1-α表达相对稳定。 4、基于荧光定量PCR所获得的Ct值，使用BestKeeper,NormFinder和geNorm三个内参基因稳定性评价软件系统地评估候选内参基因的稳定性。在多倍体组织中，BestKeeper显示RPS18稳定性最好，NormFinder显示RPLP2稳定性最好，geNorm显示稳定性较好的是RPS5,RPS18;在多倍体细胞中，BestKeeper显示EF1-α稳定性最好，NormFinder显示稳定性较好的是RPS5,RPS18,geNorm显示稳定性较好的也是RPS5,RPS18。由于不同软件得出的结果有差异，为了使结果更加准确，综合了三个软件结果进行综合排名，结果显示在多倍体组织和多倍体细胞中，排名第一的均是RPS5,其次是RPS18。 综合上述研究结果，表明RPS5和RPS18是多倍体鱼在体组织和离体培养细胞中荧光定量PCR中相对稳定的内参基因。本研究中确定的内参基因将成为多倍体鱼类分子生物学的有用工具。
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