摘要: 白细胞介素9（interleukin-9，IL-9）是一种T细胞生长因子，来源于TH2、TH9、TH17、调节性T细胞(Treg)等T辅助细胞亚群，但主要由辅助性T细胞(TH9)分泌。IL-9在超敏反应、自身免疫性疾病、抗寄生虫感染和肿瘤免疫等疾病发生发展中具有重要作用，但IL-... 展开 白细胞介素9（interleukin-9，IL-9）是一种T细胞生长因子，来源于TH2、TH9、TH17、调节性T细胞(Treg)等T辅助细胞亚群，但主要由辅助性T细胞(TH9)分泌。IL-9在超敏反应、自身免疫性疾病、抗寄生虫感染和肿瘤免疫等疾病发生发展中具有重要作用，但IL-9对骨代谢的影响未见报道。有研究发现IL-9的缺失抑制了Ⅱ型先天性免疫细胞(ILC2)的增殖，同时抑制调节性T细胞(Treg)的激活，导致血清转移性关节炎(SIA)小鼠出现关节软骨过度破坏，加剧骨质丢失;而过表达IL-9后可以促进了ILC2的增殖和Treg细胞的激活，减轻了炎症反应，同时减少了骨量丢失。 本研究旨在探讨IL-9缺失后对小鼠骨量变化的影响，并对其机制进行初步探究，为寻找潜在的疾病干预靶点提供依据，为骨质破坏相关疾病的诊疗提供新的思路和策略，具有重要的科学意义和临床价值。 目的:探究IL-9对骨代谢的影响及其机制。 方法:收集不同年龄阶段的（2月龄、3月龄、6月龄、12月龄和18月龄）野生型小鼠(WT)和IL-9敲基因小鼠（IL-9-/-）血清、脾脏和骨组织。micro-CT扫描股骨分析相关骨量参数。ELISA检测血清中骨钙素(OC/BGP)和Ⅰ型胶原交联羧基端肽(CTX)的含量。流式细胞术分析脾脏中的免疫细胞和骨髓中的免疫细胞、成骨前体细胞、破骨前体细胞比例。组织形态学染色观察骨髓腔中骨量情况。钙黄绿素双标实验检测动态骨形成情况。酸银法钙盐染色(VonKossa)实验检测骨矿化能力。克隆形成单位(Colony-FormingUnits，CFU-F)染色、碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，ALP)染色和茜素红染色实验检测骨髓间充质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells，BMMSCs)的数量及成骨分化情况。 分离WT小鼠和IL-9-/-小鼠全骨髓细胞培养BMMSCs，传代后流式检测干细胞表型后备用。CCK8检测BMMSCs的增殖情况。BMMSCs经成骨诱导7天进行ALP染色和实时荧光定量PCR(Quantitativerealtimepolymerasechainreaction，qRT-PCR)检测成骨相关基因。BMMSCs经成骨诱导14天进行茜素红染色。BMMSCs经成骨诱导3天Westernblot检测JAK/STAT信号通路和成骨相关蛋白表达。 分离WT小鼠和IL-9-/-小鼠全骨髓细胞培养骨髓来源的单核/巨噬细胞(Bonemarrow-derivedmacrophage，BMMs)，加入适量的M-CSF和RANKL，qRT-PCR检测BMMs破骨相关基因表达情况。TRAP染色和骨架染色检测BMMs破骨向分化情况。骨吸收实验检测BMMs骨吸收能力。 结果:micro-CT分析显示，与WT小鼠相比，IL-9-/-小鼠骨形态相关参数显著降低。ELISA结果显示，与WT小鼠血清相比，IL-9-/-小鼠血清中OC/BGP含量显著降低，但是两者CTX含量没有明显差异。流式细胞术结果显示，与WT小鼠相比，IL-9-/-小鼠脾脏中Treg细胞显著降低，IL-9-/-小鼠骨髓中BMMSCs细胞比例显著升高，但是成骨前体细胞比例显著下降。股骨H&E染色、Col1免疫组化、Masson染色和TRAP染色结果显示，与WT小鼠相比，IL-9-/-小鼠骨髓腔中骨小梁减少，Col1阳性细胞数目减少，胶原形成减少，TRAP阳性细胞数目也减少。钙黄绿素双标实验显示，与WT小鼠相比，IL-9-/-小鼠骨髓腔中的小梁骨数目显著较少，且骨形成速度较慢。vonKossa显示，与WT小鼠相比，IL-9-/-小鼠股骨中钙沉积颜色较浅;同时，IL-9-/-小鼠股骨中钙沉积阳性细胞数目也显著低于WT小鼠。CFU-F染色结果显示，与WT小鼠BMMSCs相比，IL-9-/-小鼠BMMSCs克隆数目较多，但其ALP阳性细胞和茜素红染色阳性细胞数量较少。 WT小鼠和IL-9-/-小鼠BMMSC具有干细胞形态，CD29阳性表达率达到90％以上，CD34、CD45等表达率在10％左右。CCK-8检测其增殖没有明显差异。ALP染色和茜素红染色及量化结果表明IL-9-/-小鼠BMMSCs成骨能力减弱，而外源性加入IL-9可以改善IL-9-/-小鼠BMMSCs成骨能力。qRT-PCR结果显示IL-9-/-小鼠BMMSCs中成骨相关基因骨钙素(Osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)、1型胶原（RecombinantCollagenTypeⅠ，Col1）的表达能力较弱，同样加入IL-9以后可以促进其成骨能力。WB结果显示，与WT小鼠BMMSCs相比，IL-9-/-小鼠BMMSCs成骨相关蛋白表达较低，且STAT3磷酸化水平也较低;加入外源性IL-9后可以同时促进WT小鼠IL-9-/-小鼠BMMSCs成骨相关蛋白的表达，同时促进STAT3磷酸化水平。 IL-9-/-小鼠BMMs细胞TRAP、NFATC1、OSCAR和DC-STAMP等破骨相关基因显著低于WT小鼠，IL-9-/-小鼠BMMs细胞TRAP染色阳性细胞数目显著低于WT小鼠。加入外源性IL-9可以促进WT小鼠BMMs细胞破骨相关基因的表达，促进TRAP染色阳性细胞数目;同时也可以促进IL-9-/-小鼠BMMs破骨分化能力。骨吸收实验结果显示加入外源性IL-9可以促进BMMs向破骨细胞分化，增强其骨吸收能力。 结论:IL-9缺失致小鼠BMMSCs骨形成能力显著降低;同时其BMMs骨吸收能力降低。但骨形成能力下降程度大于骨吸收下降程度，导致小鼠骨量降低。 收起