摘要: 16S扩增子的扩增和测序已广泛应用于口腔微生物结构研究。但是，DNA提取方法和16S rRNA可变区是否以及如何影响菌群结构的分析结果，目前仍不明确。为解决此问题，本研究首先利用由5个相同丰度的口腔细菌物种构成的模拟菌群，利用6个常用的DNA提取方法... 展开 16S扩增子的扩增和测序已广泛应用于口腔微生物结构研究。但是，DNA提取方法和16S rRNA可变区是否以及如何影响菌群结构的分析结果，目前仍不明确。为解决此问题，本研究首先利用由5个相同丰度的口腔细菌物种构成的模拟菌群，利用6个常用的DNA提取方法，从3个不同的16S rRNA可变区引物来分别提取16S rRNA扩增子，并采用Illumina MiSeq测序平台对测序序列进行比较分析。同时，本研究亦评价特定不同16S可变区的技术可重现性。本研究发现，不同DNA提取方法对于模拟菌群的多样性分析有显著影响，而不同可变区的影响则相对较小。与其他任何不加磁珠或者溶菌酶的DNA提取方法相比，同时加磁珠和溶菌酶的DNA提取方法可以提供更为准确的菌群结构。而与V1-V3可变区相比，V3-V和V4-V5可变区倾向于提供更高可重现性的结果。无论是测序批次或者实验操作者对菌群多样性的重现性均无影响。研究结果表明，DNA提取策略和16S rRNA高可变区的选择均会对口腔菌群生物多样性的结果产生影响，因此在相关实验设计和数据分析过程中需慎重选择以上参数。 同时，统计评估方法的选择亦是获得菌群准确结构的重要因素。因此，本文接下来利用模拟菌群进行统计方法学评估。通过一系列统计方法对菌群的微生物群落结构复杂度、多样性、物种相对丰度和结构进行评估，本研究发现，统计方法对于模拟群落的微生物群落评估至关重要。 最后，本文分别利用土壤提取试剂盒和棉签拭子试剂盒，从V1-V3和V3-V4两个不同可变区对扩增子序列进行提取，并应用于中国人群口腔菌斑和唾液样本的分析。从两名成人和三名儿童身上分别提取了两个牙菌斑样本和三个唾液样本。此外，本文中所使用的以上两种试剂盒之前未在口腔菌群多样性研究中使用过。结果表明，V1-V3和V3-V4两种高可变区的数据在非共有物种鉴定方面呈现不同结果。另一方面，虽然不同的DNA提取方法均能成功地测定每个物种的相对丰度，然而，利用土壤提取试剂盒在V1-V3高可变区所提取的序列，测定出的物种相对丰度往往偏高一些。另外，利用V3-V4高可变区所鉴定的物种在OTU层上的相对丰度较低，但是，该区域识别的非共有物种的数量较高。在口腔菌斑和唾液样品中V1-V3和V3-V4两个高可变区均能鉴定出非共有物种。综上所述，DNA提取方法和高变区的选择极大地影响了口腔菌斑和唾液样本中微生物多样性的测定。这项研究能够为接下来的人类口腔微生物菌群研究实验设计提供新的思路与经验。 收起