摘要: 由Didymella bryoniae引起的蔓枯病是葫芦科作物中常见的真菌性病害，主要通过侵染叶片和茎部，造成植株死藤烂叶、果实腐烂，严重影响作物产量和品质。作为重要的园艺作物，黄瓜在我国拥有悠久的栽培历史，广泛的种植范围，然而由于黄瓜遗传基础狭窄... 展开 由Didymella bryoniae引起的蔓枯病是葫芦科作物中常见的真菌性病害，主要通过侵染叶片和茎部，造成植株死藤烂叶、果实腐烂，严重影响作物产量和品质。作为重要的园艺作物，黄瓜在我国拥有悠久的栽培历史，广泛的种植范围，然而由于黄瓜遗传基础狭窄，栽培种中缺乏优异稳定的蔓枯病抗性资源，极大地限制了抗病育种工作。黄瓜野生种中有大量优异抗病基因，因而通过种间渐渗的途径发掘利用黄瓜近缘野生种抗病基因，对于改良黄瓜抗性具有重要意义。 通过种间杂交得到的渐渗系IL77，对蔓枯病有稳定抗性。通过构建遗传图谱进行QTL定位，并利用二代测序技术开展混池测序(BSA-Seq)，能够快速发掘抗病基因，大大缩短了育种年限。而转录组测序技术通过检测全基因组范围内基因表达情况，进行差异基因筛选分析，对于明确相关抗病机制具有重要意义。 本研究主要利用传统图位克隆及测序技术，发掘黄瓜抗蔓枯病相关基因，研究黄瓜抗蔓枯病分子调控机制，具体结果如下: 1.抗蔓枯病主效QTL定位 以极抗蔓枯病材料IL77和极感蔓枯病材料8419为亲本，构建重组自交系，利用子代F2∶6群体构建了一张由SSR和Indel标记构成的遗传图谱。SSR引物序列来源于‘9930’和‘Gy14’黄瓜基因组测序信息，Indel引物来自于IL77与8419亲本重测序。对均匀分布在7条染色体上的1335对SSR引物及31对Indel引物先后在亲本IL77和8419及子代F2∶6群体进行多态性分析，构建了包含137对SSR引物及6对Indel引物的遗传图谱。最长的连锁群在6号染色体，最短的在1号染色体，每个连锁群标记数目在11～35之间。 通过2017春季(2017S)、秋季(2017F)对幼苗接种蔓枯病菌后的表型统计，以LOD2.0为阈值，两季都检测到1个抗蔓枯病主效QTL位点，同在Chr1上，位于SSR22637～UW083739之间，LOD值分别为2.5和2.3，可解释表型变异率分别为12.1％和11.3％，遗传距离为7cM，物理位置22.8Mb-27.5Mb之间。同时对亲本IL77重测序以及由子代F2∶6构建抗感混池测序，结合传统定位结果，将抗蔓枯病候选基因定位在1号染色体24.6～27.1Mb之间。 2.转录组学研究抗蔓枯病相关通路 对抗病材料IL77(R)和感病材料8419(S)接种蔓枯病菌，并分别在接种0、2、4、6天后取样进行RNA-seq，通过R2VS R0、R4VS R0、R6VS R0以及S2VS S0、S4VS S0、S6VS S0比较，筛选出持续上调和下调的差异基因进行KEGG通路分析及qRT-PCR验证，最终筛选得到23个差异基因在抗性材料IL77或感病对照8419中参与了群体感应、NOD类感应元件、苯丙烷代谢通路，作为黄瓜抗蔓枯病候选基因。 3.黄瓜抗蔓枯病候选基因筛选与鉴定 通过传统QTL定位及构建极端混池测序，将主效QTL区间缩小到Chr124.6～27.1Mb范围内，与参考基因组9930测序数据比对后发现，共有13个基因在外显子区域发生15处非同义突变，通过对这13个基因的注释，发现Csa1G654870编码Dicer类蛋白，在拟南芥中的同源基因AT3G03300在芜菁皱缩病毒侵染过程中替代DCL4产生ta-siRNAs与抗病相关，Csa1G654870与AT3G03300序列相似性达到61.6％，蛋白质序列相似性达到55.7％，且能够编码抗病反应的Dicer蛋白，因此推断Csa1G654870是抗蔓枯病候选基因。 通过RNA-seq对抗感材料接种前后进行差异基因分析并得到抗病相关代谢通路，共有23个基因在群体感应、NOD类感应元件、苯丙烷代谢通路中参与了抗病反应。综合QTL定位结果及转录组测序预测Csa1G654870与参与群体感应、NOD类感应元件、苯丙烷代谢通路的23个差异表达基因可能是黄瓜抗蔓枯病候选基因。 收起