摘要: 背景及目的： 本研究首先通过构建大鼠诱导膜骨缺损模型，结合人工材料植入，研究诱导膜对植入材料成骨基因表达的调节作用，以探讨未来应用人工材料结合膜诱导技术修复骨缺损的可能性。 其次，骨替代物临床应用面临的难点，最主要的是移植后不... 展开 背景及目的： 本研究首先通过构建大鼠诱导膜骨缺损模型，结合人工材料植入，研究诱导膜对植入材料成骨基因表达的调节作用，以探讨未来应用人工材料结合膜诱导技术修复骨缺损的可能性。 其次，骨替代物临床应用面临的难点，最主要的是移植后不能快速建立血运，不能提供营养成分和排出代谢产物，影响了宿主具有成骨作用的干细胞的募集，因此，如何尽快重建局部的血运，这是骨替代物能够顺利骨重建的基础。EPCs具有维持血管内环境稳定的重要生理作用，并在骨缺损部位调节血管新生，促进血管生成，提高人工骨移植的成活率。因此，研究了骨保护素（OPG）改善骨缺损部位EPCs的活性、增强EPCs的迁移功能、促进EPCs形成新生血管的作用，为人工骨的顺利血管化和成骨提供了新思路。 另外，成骨细胞在移植骨的新骨形成方面发挥重要作用。目前已经发现在骨的生物学领域，一些LncRNA可通过多种机制调控骨组织的细胞功能，参与骨骼疾病的某些病理过程。截至目前，关于LncRNA在骨形成和重建中作用的研究，主要集中在BMSC和成骨细胞上。因此，又通过干预LncRNA UCA1(尿上皮癌相关1)，研究其对成骨细胞的增殖和成骨相关基因表达的影响，研究其在骨缺损修复中的作用和可能的调节机制，为创造诱导膜内骨替代物移植后的成骨微环境和防止骨吸收，提供新手段。 方法： 1、诱导膜技术结合不同生物材料促进成骨基因表达的研究 制作生物材料双相磷酸钙（BCP）、氧化海藻酸钠-海藻酸钠（OSA-SA）、氧化海藻酸钠-海藻酸钠-羟基磷灰石（OSA-SA-HA）支架。构建大鼠诱导膜模型，HE和Masson染色观察诱导膜形成情况。诱导膜下股骨钻孔，分别植入BCP、OSA-SA、OSA-SA-HA支架材料，术后1、6、9周取材，RT-PCR检测Runt相关转录因子2（Runx2）、骨形态蛋白-2（BMP-2）、胶原1（Col-I）、碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）成骨基因表达情况，了解诱导膜对生物材料的成骨作用，Western blotting检测第1周p-ERK和ERK的表达，并对p-ERK/ERK的结果进行定量分析，了解诱导膜发挥成骨作用的机制。 2、诱导膜技术中促进移植骨的血管化机制研究 体外培养人外周血EPCs，OPG和CXCR4受体阻滞剂(AMD3100)和PI3K受体阻滞剂(Ly294002)预处理后，使用细胞划痕试验和Transwell试验，评估了OPG对EPCs迁移的影响，通过Western blot检测CXCR4及下游p-AKT蛋白表达，研究OPG调节EPCs的作用机制。通过制作大鼠诱导膜合并骨缺损模型，植入骨替代物BCP，并给予OPG处理4周后，通过Micro-CT及HE和Masson染色对骨缺损修复情况进行评估。然后，免疫组化染色检测EPC标记物和血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的表达，用免疫荧光染色对骨缺损区域血管生成进行评估。 3、诱导膜技术中促进BMSCs迁移的机制研究 体外培养大鼠BMSCs，通过Transwell实验，研究SDF-1诱导BMSCs体外迁移的最佳作用浓度，并研究CXCR4受体阻滞剂AMD3100对BMSCs迁移的影响。通过动物实验制作诱导膜模型，并在诱导膜形成后，进行膜内植入骨替代物BCP，DIR标记BMSCs，注射入动物模型，用活体成像技术研究诱导膜形成过程中，和诱导膜内植骨后，BMSCs在大鼠体内的示踪效应，了解BMSCs向植骨区域迁移情况，探讨BMSCs在诱导膜形成和促进成骨的可能迁移机制。 4、部分促进成骨细胞的增殖和分化机制研究 收集52例住院患者和30例健康体检者血清样本，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测LncRNA UCA1在骨质疏松患者和健康受试者中的表达水平。利用小干扰RNA(siRNA)构建稳定敲除UCA1的大鼠成骨细胞MC3T3-E1。利用细胞计数Kit-8(CCK-8)检测UCA1敲除对成骨细胞增殖的影响，利用EdU染色检测对照组和UCA1敲除组成骨细胞中EdU阳性细胞的比例。RT-PCR检测Runx2、胶原1α1(Col1α1)、OCN、OPG、骨桥蛋白(OPN)、Osterix(OSX)等差异相关基因的mRNA水平，Western blotting检测Runx2蛋白水平。此外，成骨细胞在培养基中培养21天，然后通过茜素红染色(alizarin red staining)和碱性磷酸酶染色(alkaline phosphatase staining，ALP)检测其成骨分化情况。最后，利用Western blotting分析骨形态发生蛋白2(BMP-2)/(Smad1/5/8)信号通路的表达，了解LncRNA UCA1敲除后促进成骨细胞增殖和分化的作用机制。 结果： 1、诱导膜动物模型构建后，诱导膜内植入不同材料，RT-PCR检测不同时间段成骨基因的表达，结果显示，BCP组在第1周的Runx2表达量提高明显，而第1周时OSA-SA-HA组的BMP-2具有最高表达量。在COL-I表达方面，BCP组的表达量在三个时间节点均最高；在ALP表达方面，在第6周，BCP组与OSA-SA组均达到最高值；在第9周，三组的ALP表达量均高于Blank组，OSA-SA组最高；在OCN的表达量方面，BCP组第6周达到最大值。说明在诱导膜存在的条件下，BCP组填充支架显示出更好的骨诱导活性，能够在各成骨时序点上明显的上调Runx2，Col-I，ALP和OCN的表达量。在诱导膜技术修复骨缺损时，ERK1/2信号通路也能够良好发挥调控成骨相关基因表达的作用，从而促进骨重建。 2、在细胞划痕实验和迁移实验中，各组间EPC水平的差异，均显示OPG处理组促进细胞迁移，AMD3100和LY294002组则抑制OPG的迁移功能。OPG处理的内皮祖细胞CXCR4和p-AKT水平升高，说明OPG通过CXCR4信号通路对EPCs发挥调节作用。构建诱导膜骨缺损模型，用OPG处理后，免疫组化、免疫荧光染色和Micro-CT提示OPG能促进大鼠骨缺损的血管生成和骨修复，AMD3100和LY294002能消除这些作用。说明在诱导膜存在情况下，OPG可以促进EPCs迁移到植骨区，并通过CXCR4通路发挥血管化的作用，促进新生血管形成和骨修复。 3、体外培养条件下，100ng/mL SDF-1浓度时，诱导BMSCs细胞迁移效应最显著，加入SDF-1抑制剂AMD3100后，迁移细胞数量明显减少，说明SDF-1通过SDF-1/CXCR4轴以浓度梯度方式诱导BMSCs迁移。构建大鼠诱导膜形成模型和诱导膜内植骨模型，DIR碘化物标记BMSCs，不同时间段进行活体成像，可见骨水泥组（诱导膜形成组）和诱导膜内植骨组BMSCs向手术区域迁移；用AMD3100处理后仅少量BMSCs细胞向手术部位聚集，说明手术部位具有较高浓度SDF-1，并且诱导BMSCs参与诱导膜形成，以及诱导膜内植骨后的成骨过程。 4、大部分骨质疏松患者血清LncRNA UCA1表达明显升高，推测UCA1可能参与了骨质疏松的发病机制，即该因子可能具有促进骨吸收、抑制新骨形成的作用。为了深入研究UCA1在成骨细胞中的作用，构建了UCA1敲减的MC3T3-E1细胞。CCK-8检测和EdU染色显示UCA1siRNA组成骨细胞的增殖活性明显高于对照组(p<0.05)，说明抑制UCA1后细胞的增殖能力显著增强。RT-PCR实验表明，UCA1siRNA组Runx2、Collagen1a1、OC、OPG、OPN、OSX在mRNA水平高于对照组(p<0.05)，说明UCA1siRNA组细胞成骨分化能力明显增强，ALP染色和茜红素染色也证实UCA1siRNA组细胞成骨分化能力增强。此外，通过Western blotting检测各组BMP-2、磷酸化Smad1/5/8和总Smad1/5/8蛋白表达水平，显示UCA1敲除后成骨细胞中BMP-2/(Smad1/5/8)信号通路显著激活。 结论： 1、在诱导膜存在的条件下，BCP组填充支架显示出更好的骨诱导活性，能够在各成骨时序点上明显的上调Runx2，Col-I，ALP和OCN的表达量。说明诱导膜结合生物材料，可以起到促进成骨的作用，有望在未来替代自体骨移植。 2、在诱导膜结合BCP存在情况下，OPG通过CXCR4信号通路，可以诱导EPCs细胞迁移到骨缺损区域，促进新生血管生成，实现移植骨的血管化，从而有助于新骨形成，增强移植骨的重建能力。 3、体外实验表明SDF-1可以通过SDF-1/CXCR4轴诱导BMSCs迁移。动物活体成像实验发现BMSCs可以大量迁移到手术区域，说明手术区域有大量SDF-1因子，BMSCs被SDF-1募集到手术区域，参与了诱导膜的形成，以及诱导膜内植骨的骨重建过程。 4、针对诱导膜内植入骨替代物后成骨不良的情况，可以通过激活成骨细胞中BMP-2/(Smad1/5/8)信号通路，敲减LncRNA UCA1促进成骨细胞的增殖，促进成骨相关基因的表达。因此，UCA1有望成为骨移植后促进新骨形成、抑制骨吸收新的治疗靶点。 收起