摘要: 本文对热休克蛋白90对大鼠骨髓间充质干细胞存活和运动能力进行了研究。本研究分为两个部分： 第一部分：热休克蛋白90对缺氧和缺血清诱导大鼠骨髓间充质干细胞的凋亡保护作用通过PI3K/Akt和ERK1/2通路。 目的：研究HSP90对由缺氧/缺血清诱导的... 展开 本文对热休克蛋白90对大鼠骨髓间充质干细胞存活和运动能力进行了研究。本研究分为两个部分： 第一部分：热休克蛋白90对缺氧和缺血清诱导大鼠骨髓间充质干细胞的凋亡保护作用通过PI3K/Akt和ERK1/2通路。 目的：研究HSP90对由缺氧/缺血清诱导的骨髓间充质干细胞凋亡是否有拮抗作用，同时研究那些可能机制参与了HSP90的抗凋亡作用。 方法：通过全骨髓培养的方法获得大鼠骨髓间充质干细胞，经过体外培养以后，取3-5代的骨髓间充质干细胞进行实验。对实验的骨髓间充质干细胞进行细胞表面标志物CD44，CD45，和CD90应用流式细胞仪进行鉴定。对骨髓间充质干细胞给予缺氧/缺血清培养24小时后，获得稳定的凋亡模型。为了观察HSP90对骨髓间充质干细胞的作用，给予人重组HSP90α(0，0.01，0.1，1和10μ mol/L)处理骨髓间充质干细胞24小时，接着再给予常氧(O221％)或缺氧(O21％)/缺血清培养24小时。通过四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)对细胞的活力进行检测。对骨髓间充质干细胞的凋亡检测采用Hoechst33258染色和Annexin V/PI方法。通过以上方法得出HSP90最佳的抗细胞凋亡的浓度。应用实时定量-PCR检测骨髓间充质干细胞细胞膜表达的V-erb-b2 rythroblasticleukemia-viral oncogene homolog2(ErbB2)和Toll-like-receptor-4(TLR-4)的mRNA水平。应用Western blot法观察了凋亡相关蛋白cleaved caspase-3，Bcl-2，Bax，Bcl-xL的水平。以及HSP90抗细胞凋亡的下游信号通路AKT和ERK1/2的磷酸化水平。最后通过比色法检测了细胞上清内的一氧化氮(Nitric oxide，NO)的产量，来反映骨髓间充质干细胞在缺氧/缺血清作用下的一氧化氮的分泌量。 结果：从SD大鼠得到的骨髓间充质干细胞经过培养以后，对其进行细胞鉴定。绝大部份骨髓间充质干细胞的细胞表面的CD44和CD90都是阳性的，而CD45阴性。给予人重组HSP90α(0，0.01，0.1，1和10μmol/L)预处理骨髓间充质干细胞24小时，再给予常氧(O221％)或缺氧(O21％)/缺血清培养24小时。实验发现，rhHsp90α在1-10μmol/L浓度范围都能显著的对抗由缺氧/缺血清诱导的干细胞凋亡。Hsp90减少cleaved caspase-3和Bax的表达，增加Bcl-2，Bcl-xL的表达水平。同时，促进NO的分泌，信号通路AKT和ERK1/2参与hsp90的保护作用。 第二部分：Hsp90在骨髓间充质干细胞的细胞迁移中的作用。 目的：研究MSCs在体外经过Hsp90处理后，能否促进骨髓间充质干细胞的细胞迁移活动。并对这些迁移活动的机制进行初步。 方法：经过常规差速贴壁培养得到的骨髓间充质干细胞后，按实验分组分为，正常对照组，转染siRNAHsp90α，17-AAG组，wortmannin组，U0126组。用细胞划痕实验以及Transwell实验观察细胞的迁移能力。用明胶酶谱法检测细胞上清中的MMP-2和MMP-9的活性。用定量-PCR法检测CXCR4和VCAM-1的mRNA表达水平。用Westeen-blot检测了MSCs表达的MMP-2和MMP-9的蛋白水平，以及，phospho-Akt，phospho-ERK1/2的蛋白水平。 结果：MSCs经过24小时的RhHsp90α(10nM)处理后的细胞，和未予RhHsp90α(10nM)处理组相比，能显著提高MSCs的迁移能力。应用(17-AAG，40 nmol/L，)后，和对照组相比能明显抑制MSC的迁移能力。应用wortmannin(10μ m)，和U0126(10μ M)后迁移的细胞明显比RhHsp90α处理组减少。Real-time PCR检测表明，siRNAHsp90α组和正常对照组相比Hsp90α的表达下调88.1±3.5％。同时细胞的迁移能力和正常对照组相比也明显下降3倍。明胶酶谱法检测表明，RhHsp90α处理24小时后，细胞上清中的MMP-2和MMP-9的活力比正常对照组明显增加，细胞用17-AAG(40nM)，wortmannin(0.2μ M)以及U0126预处理后，细胞的MMP-9活性与RhHsp90α处理组相比明显被阻断。MSCs给予rhHsp90α(10nM)处理后，MMP-2和MMP-9的蛋白水平与对照组相比明显提高。17-AAG预处理MSCs后，与rhHsp90α组相比，细胞的MMP-9和MMP-2水平显著下降。wortmannin处理后，与rhHsp90α组相比，细胞的MMP-9水平显著下降，而MMP-2的水平没有明显变化。U0126处理后，细胞的MMP-9和MMP-2水平显著下降与RhHsp90α组相比。MSCs经过RhHsp90α处理后，显著上调VCAM-1和CXCR4的mRNA水平。17-AAG预处理MSCs后，VCAM-1和CXCR4的mRNA水平显著下降。Wortmannin和U0126都能显著降低MSCs的VCAM-1和CXCR4的mRNA表达水平。PI3K/Akt和ERK途径同时参与RhHsp90α介导的MSCs的迁移作用。 结论：⑴RhHsp90α体外处理能促进骨髓间充质干细胞迁移能力。⑵SiRNAHsp90能干扰Hsp90α的促进骨髓间充质干细胞迁移能力。⑶MMP-2和MMP-9参与了RhHsp90α体外处理促进骨髓间充质干细胞迁移能力这一过程。⑷CXCR4和VCAM-1参与了RhHsp90α体外处理促进骨髓间充质干细胞迁移能力这一过程。⑸PI3K/Akt和ERK途径参与RhHsp90α介导的骨髓间充质干细胞的迁移作用。 收起