摘要: 目的：基因工程和组织工程技术的不断发展,为修复骨缺损及促进脊柱融合提供了更多的治疗选择。其中LIM矿化蛋白(LIMmineralization protein,LMP)是近年来研究的热点。本实验通过构建真核表达质粒pBudCE4.1-LMP-1-LMP-3、pBudCE4.1-LMP-1和pBudCEA.1-L... 展开 目的：基因工程和组织工程技术的不断发展,为修复骨缺损及促进脊柱融合提供了更多的治疗选择。其中LIM矿化蛋白(LIMmineralization protein,LMP)是近年来研究的热点。本实验通过构建真核表达质粒pBudCE4.1-LMP-1-LMP-3、pBudCE4.1-LMP-1和pBudCEA.1-LMP-3,并分别转染兔骨髓间充质干细胞,观察实验各组LMP-1与LMP-3基因和蛋白表达情况,比较携带双基因与携带LMP-1或LMP-3单基因的骨髓间充质干细胞在表达上的差别,为进一步动物实验提供理论支持。 方法：⑴将人工合成含HindⅢ/BamHⅠ酶切位点的人LMP-1基因片段及含Xhol/kpnⅠ酶切位点的人LMP-3基因片段分别与中介质粒Puc57进行连接反应,构建质粒Puc57-LMP-1和Puc57-LMP-3,并行酶切和测序鉴定。⑵LMP-1和LMP-3基因分别和真核双表达质粒pBudCE4.1进行连接反应,分别构建质粒pBudCE4.1-LMP-1和pBudCE4.1-LMP-3,经过酶切和测序证实,并在重组质粒pBudCE4.1-LMP-1的基础上再进行与LMP-3的连接反应,再经酶切及测序鉴定。⑶分离、培养兔骨髓间充质干细胞,对细胞进行镜下形态学观察。将细胞分为五组即A:空白对照组B:pBudCE4.1组C:pBudCE4.1-LMP-1组D:pBudCE4.1-LMP-3组E:pBudCE4.1-LMP-1-LMP-3组。用脂质体法将四种质粒按分组在体外分别转染至兔骨髓间充质干细胞。⑷对上述五组分别进行RT-PCR和Western Blot检查其基因和蛋白表达,并比较其组间差异性。 结果：①酶切及测序证实质粒Puc57-LMP-1、Puc57-LMP-3、pBudCE4.1-LMP-1、pBudCEA.1-LMP-3及pBudCE4.1-LMP-1-LMP-3真核双表达质粒构建成功。②该双表达质粒在体外转染MSCs细胞后可表达LMP-1和LMP-3分子。③对RT-PCR及Western Blot检测结果行灰度值测量显示:LMP-1 mRNA及蛋白水平的表达,A、B组与C、D、E组间差异有统计学意义(P<0.05),C组与E组差异无统计学意义(P>0.05)；LMP-3 mRNA及蛋白水平的表达,A、B组与C、D、E组间差异有统计学意义(P<0.001),D组与E组差异有统计学意义(P<0.05),C组及D组在LMP-1及LMP-3的表达上的差异无统计学意义(P>0.05)。 结论：⑴成功构建pBudCE4.1-LMP-1、pBudCEA.1-LMP-3和pBudCE4.1-LMP-1-LMP-3真核表达质粒。⑵转染pBudCE4.1-LMP-1-LMP-3的骨髓间充质干细胞能在体外同时表达LMP-1和LMP-3分子。⑶双基因转染显著提高了LMP-3的表达水平,LMP-1与LMP-3之间存在互表达作用。 收起