摘要: 背景: 脓毒症是一种由各种致病微生物和内毒素释放引起的全身炎症反应综合症(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，也是病人在受到急恶性创伤和休克后常出现的并发症。高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1, HMGB1)主要是... 展开 背景: 脓毒症是一种由各种致病微生物和内毒素释放引起的全身炎症反应综合症(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，也是病人在受到急恶性创伤和休克后常出现的并发症。高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1, HMGB1)主要是体内的免疫细胞如单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞在受到内毒素和炎症因子的刺激后产生和分泌的，在脓毒症发生和发展中扮演重要作用，在脓毒症中HMGB1是一个重要的免疫调控因子。HMGB1与其他的免疫调节因子相互作用，调控机体的免疫反应，诱导和增强机体的免疫反应。研究表明HMGB1能够促进巨噬细胞的迁移，以及各种炎症因子的释放，这些炎症因子能够促进各种免疫细胞的聚集，进而诱导脓毒症的免疫反应。已有研究证实，HMGB1表达的上调与脓毒症的发生密切相关。微小RNA(microRNA)在真核生物中是高度保守的内源非编码小RNA，能够通过与mRNA的3'-UTR(3'-untranslated region)完全和不完全互补的方式来调控靶基因的表达，调控免疫细胞的激活、炎症因子的释放以及免疫反应的发生。越来越多的研究表明microRNA参与到脓毒症的发生和发展，临床上可以将microRNA作为脓毒症诊断的分子标志物。同时，脓毒症病人外周血中的miR-25的表达也发生异常，这说明miR-25的异常可能与脓毒症的病理过程有关。生物信息学研究分析表明HMGB1的3'-UTR存在一个miR-25靶向结合的位点。然而，miR-25是否能调控HMGB1的表达以及miR-25和HMGB1的表达异常对脓毒症的生物学影响，这些都尚不清楚。 目的: 分析脓毒症病人体内miR-25和HMGB1的表达，阐述miR-25、HMGB1和脓毒症三者之间的关系，探究miR-25在调控HMGB1的表达和巨噬细胞炎症因子的释放中的作用，为临床上寻找诊断和治疗脓毒症寻找新的靶点，为评估患者预后提供新的分子标志物。 方法: 在本研究中，我们首先利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导巨噬细胞脓血症和对照组做miRNA芯片，对结果进行聚类分析，找出差异表达的miRNA，预测目标miRNA-25。其次，我们利用LPS诱导巨噬细胞，检测巨噬细胞中miRNA-25、早期炎症因子TNF-α和IL-6、晚期炎症因子HMGB1的表达差异，利用小鼠模型分析了miR-25、HMGB1和脓毒症三者之间的关系以及对小鼠存活率的影响。最后，我们通过分析脓毒症病人体内miR-25和HMGB1的表达，探究miR-25在调控HMGB1的表达和巨噬细胞炎症因子的释放中的作用。 结果: (1)miR-25抑制脓毒症巨噬细胞炎症因子的分泌的机制研究，我们发现：首先miR-25能够靶向抑制HMGB1的表达。microRNA.org在线靶向基因预测结果表明，HMGB1mRNA的3'-UTR存在一个miR-25靶向结合的位点。miR-25mimic的表达能够显著降低相关luciferase活性，这说明miR-25能够靶向结合HMGB1的3'-UTR，从而抑制HMGB1的表达。其次，LPS能够诱导巨噬细胞分泌HMGB1，且抑制miR-25的表达。流式结果表明巨噬细胞经M-CSF诱导7天以后，巨噬细胞特定的蛋白分子标志物CD68的表达提高了80%，这说明巨噬细胞的分化成功被诱导，可进行后续实验。Elisa试验表明，细胞经过100ng/mLLPS处理48h之后，细胞上清中炎症因子HMGB1、TNF-α和IL-6的表达显著提高。qRT-PCR的结果表明，LPS的处理巨噬细胞能够显著上调HMGB1mRNA的表达，显著下调miR-25的表达。Westernblot结果表明，LPS处理能够显著增强NF-κB的转录活性，也能上调巨噬细胞HMGB1的表达。最后，miR-25能够抑制巨噬细胞HMGB1的表达和细胞迁移。细胞在转入miR-25mimic或者si-HMGB1后，巨噬细胞HMGB1的mRNA和蛋白水平显著降低，同时也导致p-p65的水平也显著降低。此外，细胞上清液中HMGB1、TNF-α和IL-6的水平也发生显著下调，巨噬细胞的迁移能力也明显受到抑制。这说明miRNA-25能够通过抑制HMGB1的表达而抑制脓毒症诱导的细胞炎症因子的表达。 (2)利用小鼠模型证明miR-25mimics能够通过调控HMGB1抑制脓毒症的进展，对照组每次注射等体积的生理盐水，LPS组在连续三天注射生理盐水之后，第四天注射浓度为1mg/ml的LPS(剂量为10mg/kg)，LPS+miRNA-25mimics组尾静脉注射miRNA-25mimics(miR-25激动剂，30mg/kg/day)，连续注射三天后，第四天尾静脉注射LPS，检测小鼠不同组织和血清中miRNA-25、HMGB1的表达情况，测量小鼠血清中细胞因子TNF-α、IL-6的水平，统计不同组脓毒症小鼠的死亡情况。结果我们发现：qRT-PCR检测不同组小鼠miRNA-25在血清和肺、肝脏、脾、心脏和肾脏等不同器官组织中的表达情况。结果发现，LPS组小鼠血清和不同组织的miRNA-25的表达明显低于对照组，两组差异具有统计学意义(p＜0.05).而小鼠在注射miRNA-25mimics之后，miRNA-25的表达上升，恢复至正常水平，与对照组差异不具有统计学意义(p＞0.05)。qRT-PCR检测不同组小鼠HMGB1在血清和肺、肝脏、脾、心脏和肾脏等不同器官组织中的表达情况。结果发现，LPS组小鼠血清和不同组织的miRNA-25的表达明显高于对照组，两组差异具有统计学意义(p＜0.05).而小鼠在注射miRNA-25mimics之后，HMGB1的表达下降，恢复至正常水平，与对照组差异不具有统计学意义(p＞0.05)。ELISA检测不同组小鼠血清中细胞因子TNF-α、IL-6的表达情况。结果发现，LPS组小鼠血清中细胞因子TNF-α、IL-6的表达明显高于对照组，两组差异具有统计学意义(p＜0.05).而小鼠在注射miRNA-25mimics之后，血清中细胞因子TNF-α、IL-6的表达下降，恢复至正常水平，与对照组差异不具有统计学意义(p＞0.05)。在给小鼠尾静脉注射生理盐水和miR-25mimics48h之后，利用尾静脉注射LPS诱导小鼠脓毒症，并观察小鼠的生存率。结果发现，与对照组相比，小鼠在注射miR-25mimics之后小鼠的10天生存率明显提高(55.88%vs20.00%)，miR-25过表达对脓毒症小鼠病死率的改善主要是从LPS诱导后4天逐渐明显。这说明在LPS诱导的脓毒症小鼠模型中，miRNA-25能够抑制小鼠HMGB1的表达，进而抑制脓毒症诱导的细胞炎症因子TNF-α、IL-6的表达。 (3)对脓毒症患者进行血清中HMGB1和miRNA-25的检测时，我们发现：与健康对照组相比，脓毒症患者外周血血清中的HMGB1的含量明显高于对照组，两组差异具有统计学意义(p＜0.05)。Westernblot结果表明与健康对照组相比，脓毒症患者外周血单核细胞(peripheral bloodmonouclear cells, PBMC)中HMGB1的表达明显高于对照组，两组差异具有统计学意义(p＜0.05)。qRT-PCR结果表明与健康对照组相比，脓毒症患者外周血血清和PBMC中的miR-25的表达均显著低于对照组，两组差异具有统计学意义(p＜0.05)。皮尔逊相关分析表明脓毒症患者血清中miR-25的表达与HMGB1的含量呈负相关(r=-0.591,P=0.041)。对于脓毒症患者来说，血清中HMGB1的含量与PBMC中HMGB1的表达呈正相关(r=0.537,P＜0.001)，血清中miR-25的表达与HMGB1的含量呈负相关(r=-0.622,P＜0.001)。 结论: LPS处理巨噬细胞组、LPS小鼠组、脓毒症患者组miR-25的下调和HMGB1的上调与脓毒症的发生有关。miR-25通过转染脓毒症小鼠能够减弱LPS诱导的HMGB1的表达，抑制NF-κB和下游炎症因子TNF-α和IL-6。因此，临床上可能将miR-25作为诊断脓毒症进程的分子标志物。 收起