摘要: 黄牛和水牛是日本血吸虫（Schistosomajaponicum）的重要天然宿主，也是我国血吸虫病的主要传染源。它们对日本血吸虫感染呈现不同的适宜性，进而导致血吸虫在宿主体内的生长发育、存活以及对宿主的致病作用呈现较大差异。为了探究miRNAs在血吸虫生长... 展开 黄牛和水牛是日本血吸虫（Schistosomajaponicum）的重要天然宿主，也是我国血吸虫病的主要传染源。它们对日本血吸虫感染呈现不同的适宜性，进而导致血吸虫在宿主体内的生长发育、存活以及对宿主的致病作用呈现较大差异。为了探究miRNAs在血吸虫生长发育以及与宿主相互作用过程中的调节作用，本研究采用高通量测序技术(Illumina的HiseqXten测序)对来自黄牛（适宜性宿主）和水牛（非适宜性宿主）的日本血吸虫成虫以及感染前（T1）、感染后14d（T2，早期感染）和感染后42d（T3，急性感染）黄牛和水牛的血浆、外周血单核细胞（Peripheralbloodmononuclearcells，PBMC）的miRNA进行测序，比较黄牛和水牛来源日本血吸虫成虫miRNA表达谱的差别以及黄牛和水牛血浆和PBMC在感染前后miRNA表达谱的变化，并对日本血吸虫真核翻译起始因子（eukaryoticinitiationfactor4，eIF4A）的生物学功能进行初探。上述研究可为抗血吸虫疫苗候选分子和新药靶标的筛选提供新的思路。 1.黄牛和水牛来源日本血吸虫成虫miRNA表达谱的比较分析。采用高通量测序技术比较了黄牛和水牛来源的日本血吸虫成虫miRNA的表达谱，分别获得了6378万和6321万条miRNA序列。通过生物信息学分析鉴定了206个miRNAs，包括79个已注释的日本血吸虫miRNAs、127个与其他物种miRNAs高度相似的新miRNAs。其中，5个已注释的miRNAs（sja-miR-124-3p、sja-miR-219-5p、sja-miR-2e-3p、sja-miR-7-3p和sja-miR-3490)在水牛组虫体中呈现显著性上调表达，10个新的miRNAs在两组虫体中呈现差异表达。sja-miR-124-3p在黄牛和水牛源虫体中的表达趋势与啮齿类宿主来源虫体一致，可参与调节日本血吸虫真核翻译起始因子eIF4A等的表达。双荧光素酶报告试验证实sja-miR-219-5p可与靶基因Hsc20特异序列结合。5个已注释的差异表达miRNAs可能参与268个靶基因的生物学功能调节，包括虫体的咽肌发育、嘌呤代谢、减数分裂的胞质分裂、减数分裂中纺锤体的定位、细胞骨架依赖性细胞内运输、rRNA加工、mRNA运输、蛋白质运输和繁殖等过程。其中，sja-miR-124-3p和sja-miR-219-5p可能通过调控虫体的神经系统发育、应激反应等进而影响虫体在两宿主体内的生存及发育。 2.黄牛和水牛感染日本血吸虫前后血浆miRNA表达谱及差异分析。采用高通量测序技术比较了黄牛和水牛在血吸虫感染不同时期血浆中miRNA的表达谱。测序后共获得352,727,942条有效序列，平均每个样本有14,696,997条。黄牛和水牛组血浆miRNA的基因组比对率分别为90.80％和99.60％。黄牛和水牛血浆在血吸虫感染各期已注释的miRNAs有1,030个，新发现的miRNAs分别为444和438个。与感染前相比，黄牛和水牛血浆在感染早期分别有3个和9个miRNAs呈现特异性差异表达；在急性感染期黄牛和水牛血浆有9个miRNAs呈现共性差异表达，黄牛和水牛血浆分别有39和23个miRNAs呈现特异性差异表达。与感染早期相比，在急性感染期黄牛与水牛血浆有4个miRNAs呈现共性差异表达，分别有35和5个miRNAs呈现特异性差异表达。GO分类和KEGG分析发现这些差异表达miRNAs的靶基因与多个信号通路有关。在感染早期，黄牛和水牛血浆miRNAs在脂肪酸代谢和胰岛素信号通路调节中存在很大差异，可能影响虫体在两宿主体内的生存及发育。 3.黄牛和水牛感染日本血吸虫前后外周血单核细胞miRNA表达谱及差异分析。采用高通量测序技术比较了黄牛和水牛PBMC在血吸虫感染不同时期miRNA的表达谱。测序后共获得228,483,170条序列，平均每个样本有9,520,132条有效序列。在血吸虫感染各时期黄牛和水牛PBMC中已注释的miRNAs有1,030个，新发现的miRNAs分别为234和228个。与感染前相比，黄牛与水牛PBMC之间在T3/T1期有45个miRNAs呈现共性差异表达，另有111和69个miRNAs呈现特异性差异表达。与感染早期相比，黄牛和水牛PBMC在T3/T2期有64个呈现共性差异表达，另有147和36个miRNAs呈现特异性差异表达。GO分类和KEGG分析发现这些差异表达miRNAs的靶基因与多个信号通路有关。在急性感染期，黄牛和水牛PBMC的miRNAs在Th1/Th2型细胞因子、Toll样受体信号通路等方面存在差异，可能影响宿主的免疫应答。 4.日本血吸虫真核翻译起始因子eIF4A的克隆表达与特性分析。根据GenBank中日本血吸虫eIF4A的基因序列（FN315265.1）设计引物，扩增Sj-eIF4A基因；构建其重组表达质粒并转化感受态细胞。采用IPTG诱导表达并纯化该重组蛋白。采用qRT-PCR法检测Sj-eIF4A在不同发育阶段以及不同适宜性宿主来源虫体的转录水平。在体内外对21d童虫中该基因进行RNA干扰实验，通过扫描电镜观察RNA干扰对虫体繁殖和结构的影响。结果显示，Sj-eIF4A基因全长为1179bp，编码392个氨基酸，融合蛋白Mr约为46kDa。Sj-eIF4A在被检的日本血吸虫不同发育阶段均有表达，尤其在毛蚴、14d童虫以及42d雌虫体内转录水平较高；在适宜性宿主黄牛和BALB/c小鼠来源虫体内的转录水平高于非适宜性宿主水牛和Wistar大鼠。Sj-eIF4A特异性siRNA不仅能够有效抑制虫体Sj-eIF4A的转录水平并诱导小鼠产生20.63％的减虫率和31.21％的肝脏减卵率，而且能够引起雌虫的排卵异常以及虫体腹吸盘和雌雄虫部分体表结构发生改变。 综上所述，本文对黄/牛来源日本血吸虫miRNA的表达差异及黄牛和水牛感染前后PBMC和血浆miRNA表达差异进行了比较分析，并对日本血吸虫真核翻译起始因子Sj-eIF4A进行了克隆表达和基因特性分析。发现了一些对血吸虫生长发育和宿主免疫应答至关重要的虫源性和宿主源性miRNA分子，初步探明了Sj-eIF4A在日本血吸虫生长发育中的重要作用，为揭示不同适宜性宿主与日本血吸虫间的相互作用提供了有价值的信息，也为寻找抗日本血吸虫有效的疫苗候选分子或新药靶标提供了新思路。 收起