摘要: Hh蛋白家族调控着一系列发育的过程和肿瘤的产生，Hh通路的失调在发育紊乱和癌症中均有作用。例如，对于指导从四肢到中枢神经系统发育、基底细胞癌和髓母细胞瘤的产生，具有深远的影响。美国药监局批准的对抗BCC转移的Hh通路抑制剂表明了Hh在癌症治疗... 展开 Hh蛋白家族调控着一系列发育的过程和肿瘤的产生，Hh通路的失调在发育紊乱和癌症中均有作用。例如，对于指导从四肢到中枢神经系统发育、基底细胞癌和髓母细胞瘤的产生，具有深远的影响。美国药监局批准的对抗BCC转移的Hh通路抑制剂表明了Hh在癌症治疗中的重要性；而且对于其它癌症的研究，许多临床试验仍在开展当中。 Hh是一个形态发生因子，它沿着发育轴线形成浓度梯度而发挥作用。在神经管发育过程中，它从脊索和底板中表达，并且一直延伸到背部。Hh蛋白是Ptch的配基。Ptch是一种12次跨膜蛋白，它能反向调节7次跨膜蛋白Smo。Hh配基与Ptch结合，导致Smo的激活。这将导致Smo转运至原纤毛中，Hh通路也得以正常转运。Smo的下游是Gli家族，它们是一组锌指转录因子。在哺乳动物中具有三个同源蛋白，Gli1、Gli2和Gli3。 Sufu作为Gli蛋白的分子伴侣，能够与所有的Gli蛋白结合而形成复合物。Sufu能够与Gli氨基端高度保守的SYGH结构域结合，又或者通过遮挡Gli的核输入信号（NLS），从而将Gli阻滞在细胞浆中，使得Gli蛋白被Sufu抑制。然而现在并不清楚Sufu对于调节Gli胞浆阻滞的具体机制。随着Hh的刺激，Gli蛋白转运至细胞核中，暗示Sufu对于Gli在胞浆中的锚定功能被解除了。然而，生物化学和遗传学研究表明Sufu调节Gli的活性是通过其它非胞浆阻滞机制。这就暗示Sufu与Gli蛋白在细胞核中仍然能够结合。然而，Sufu调控Gli蛋白的详细机制还不明确。 由于Hh在小脑发育中起到十分重要的作用，我们利用小脑为模型进行研究。在成年小鼠小脑中，Hh通路是处于静息状态，但是在出生一周多之后，小脑发育处于高强度，Sufu的水平与 Gli一样，在外胚层颗粒神经元前体中表达都很高。这部分细胞的发育高度依赖Hh信号的输出。在髓母细胞瘤这一来自于颗粒神经元前体的小脑肿瘤中，Hh通路被重新激活，与之前一样的是，Sufu的水平同Gli1一致高度上调。除此之外，Sufu在细胞核和细胞浆中均有定位。为了进一步观察Sufu在细胞核和细胞浆中的分布，我们检测了小鼠胚胎成纤维细胞系（MEFs）。在正常的MEFs中，无论Shh处理与否，Sufu在胞核和胞浆中均有分布。当我们检测Gli2/3缺失的细胞时，令我们惊讶的是Sufu在没有Shh时几乎处于细胞浆中。而当有Shh时，Sufu被诱导至细胞核中，在Gli2/3缺失的细胞中是不存在抑制子的。这就暗示在正常 MEFs 中，在没有 Shh 处理的情况下，Sufu很有可能是被抑制子带入到细胞核的。在Gli2/3缺失的细胞中，Shh诱导Sufu入核是由Gli1介导的。为了证明这一点，我们在Gli2/3缺失的细胞中稳定表达Gli1的shRNA，从而构建三种Gli都没有的细胞系。在这种细胞系中，Sufu的入核不再受到Shh的诱导。 Sufu能够招募Sin3A和HDAC从而抑制Gli的转录活性。我们重新考虑了这个模式并且探究Sufu能否出现在Gli结合位点的染色质上。我们以Gli1和Ptch1的启动子为例，利用ChIP实验，两个位点在Shh处理之后，Gli结合元件的含量增加 ，暗示Shh能够诱导Sufu招募至其靶基因启动子区域。有趣的是，我们同样发现SAP18在Hh的靶基因启动子上，Hh能够促使其从染色质上脱落。这些结果暗示Hh能够诱导Gli1-Sufu复合物附着在它的靶基因启动子区域，而且这是依赖于Gli1和Gli3抑制子。 为了找到决定Sufu在胞浆和胞核中分布的序列原件，我们做了缺失定位，最后确定在人类Sufu的308-318残基中具有潜在的NES信号。我们将其中两个亮氨酸突变成丙氨酸并且在MEFs中进行检测。相比于野生型的Sufu，NES突变的Sufu更多的出现在细胞核中。而且NES的受体CRM1也不再与突变的Sufu结合。本实验室之前报道了一个PKA和GSK3β双磷酸化位点能够调节Sufu的稳定性和原纤毛转运。这个双磷酸化位点正好处于NES的附近。在CoIP实验中，我们发现在342或者346位点不能被磷酸化而突变的Sufu与CRM1具有有效的结合能力，而模拟磷酸化的Sufu则失去了与CRM1结合的能力。最后，我们将正常Sufu-GFP与GSK-3β、PKA单独或者二者联合共转染，发现更多的Sufu在细胞核中，但是这些激酶对非磷酸化的Sufu，即双A突变并不能起到作用。 上述结果阐明了Sufu不仅能够参与Gli介导的转录、抑制信号通路，同时还能通过提高 Gli1 蛋白的细胞核转运和稳定性，从而提高 Hh 通路活性，这对于Shh通路的最大化激活是必须的。使我们对于Sufu作为Gli蛋白分子伴侣有了新的认识。 收起