摘要: 苦荞（Fagopyrum tataricum）是蓼科荞麦属的一种药食兼用的小杂粮，富含以芦丁为代表的黄酮类物质。同时，苦荞由于其生长环境的特点，还具有很强的耐受多种不利环境的能力，如干旱、UV-B辐射和冷等。因此，有关抗逆生理和黄酮代谢等方面的分子机制研... 展开 苦荞（Fagopyrum tataricum）是蓼科荞麦属的一种药食兼用的小杂粮，富含以芦丁为代表的黄酮类物质。同时，苦荞由于其生长环境的特点，还具有很强的耐受多种不利环境的能力，如干旱、UV-B辐射和冷等。因此，有关抗逆生理和黄酮代谢等方面的分子机制研究已成为苦荞研究的热点领域。目前，苦荞分子生物学研究中，用于基因表达量分析的内参基因有FtActin（肌动蛋白）、FtSAND（SAND蛋白家族）和FtH3(组蛋白H3)基因。单一使用上述基因作为内参基因，有可能导致靶基因表达量分析的不准确甚至呈现相反结果。因此，为苦荞逆境胁迫应答和黄酮代谢调控等研究提供更准确和更适合的内参基因，筛选和鉴定多种实验条件下相应稳定表达的内参基因显得至关重要。本研究以苦荞“西荞二号”为材料，参考其转录组数据及已知常用的管家基因，选择FtSAND、FtCACS（网格蛋白适配器复合体亚基蛋白家族）、FtExpressed1（未知蛋白家族）、FtA ctin FtH3、FtEF-1α（延伸因子α）和FtGAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）等7个候选内参基因，采用荧光定量PCR技术对其在不同实验条件下的表达量进行了分析，进一步采用GeNorm、NormFinder和BestKeeper三个软件分析了其表达量的稳定性。主要结果如下: 1.基于转录组数据，克隆获得了苦荞FtActin、FtGAPDH和FtEF-1α基因的cDNA序列。序列分析表明，FtActin、FtGADPH和FtEF-1α的开放阅读框分别为1134bp、1034bp和1347bp。FtActin序列与日本柳杉的同源性最高达80％，FtGADPH序列与甜荞的同源性最高达97％，FtEF-1α序列与油茶的同源性最高达93％。 2.芽期苦荞经干旱、冷、UV-B和高盐处理后取子叶和胚轴，芽期苦荞经铝处理取根，以及苦荞未成熟种子期中的根、茎、叶、花和未成熟的种子作为实验材料，经RT-qPCR测定FtSAND、FtCACS、FtExpressed1、FtActin、FtH3、FtEF-1α和FtGAPDH等7个候选内参基因的表达量，并基于内参稳定性分析软件筛选出相应条件下稳定表达的内参基因。首先，经Ct值比较表明，7条候选内参基因平均表达水平最高的是FtEF-1α(Ct=17.61)，基因表达水平最低的是FtSAND(Ct=25.6);FtActin(SD=1.83)和FtGAPDH(SD=1.49)的Ct值变异性是最大的，可能是不稳定的内参基因;FtH3变异度最小(SD=0.79)，可能是最稳定的内参基因。其次，经基因稳定性分析软件GeNorm、NormFinder和BestKeeper分析表明:在干旱胁迫下，胚轴和子叶中稳定表达的内参基因都是FtH3和FtCA CS，子叶和胚轴的混合中稳定表达的内参基因是FtSAND、FtH3、FtExpressed1和FtCACS;在冷胁迫下，稳定表达的基因都是FtH3和FtCACS;在UV-B处理下，子叶中稳定表达的基因是FtH3、FtActin和FtExpressed，胚轴中表达稳定的基因是FtSAND、FtH3和FtCACS，子叶和胚轴中稳定表达的基因是FtCACS;高盐处理下，子叶中稳定表达的基因是FtH3和FtCACS，胚轴中表达稳定的基因是FtCACS、FtExpressed1、FtH3和FtSAND，子叶和胚轴中稳定表达的是FtCACS和FtSAND;所有胁迫下，在子叶中稳定表达的基因是FtCACS和FtSAND，在胚轴中稳定表达的基因是FtSAND，同时在子叶和胚轴中稳定表达的基因也是FtSAND。铝处理下，苦荞根中稳定表达的基因是FtExpressed1和FtEF-1α。在未成熟种子期，在所有组织器官都稳定表达的基因是FtCACS和FtExpressed1。综上，上述稳定表达的基因可作为相应条件下苦荞的内参基因。 3.采用筛选出的稳定和不稳定的内参基因分别作为参照，分析了苦荞铝敏感基因FtSTAR和黄酮代谢途径关键酶基因FtDFR（二氢黄酮醇4-还原酶）的相对表达量。在铝胁迫下，苦荞FtSTAR在根中的表达分析结果显示，FtSTAR基因的表达量会上升，但是相对表达量的数值会受到内参基因的影响。以稳定表达基因FtExpressed1为内参基因时，FtSTAR表达量为胁迫前的6.24倍;以不稳定基因FtActin为内参基因时，FtSTAR表达量仅为胁迫前的2.48倍。UV-B处理下，FtDFR在胚轴中的表达分析结果显示，以稳定表达的FtCACS、FtH3和FtActin基因为内参基因，FtDFR基因表达量呈现相同的变化趋势，即随着胁迫时间的延长表达量逐渐减少;以不稳定基因FtEF-1α为内参基因时，FtDFR基因表达量呈现无规律的波动变化。 收起