摘要: 谷子(Setaria italica)是一种重要的杂粮作物，营养丰富，广泛种植于我国干旱半干旱地区。作为北方旱作生态农业建设的主体作物和应对未来极端气候条件的战略储备作物，谷子抗旱、耐贫瘠、适应性广等特性使其在当前的种植业结构调整中起着重要作用，因... 展开 谷子(Setaria italica)是一种重要的杂粮作物，营养丰富，广泛种植于我国干旱半干旱地区。作为北方旱作生态农业建设的主体作物和应对未来极端气候条件的战略储备作物，谷子抗旱、耐贫瘠、适应性广等特性使其在当前的种植业结构调整中起着重要作用，因此对谷子非生物胁迫下的相关研究尤为重要。实时荧光定量PCR是研究基因表达水平最常用的方法，利用该方法分析基因的相对表达量时，需要选择一个或者多个稳定表达的内参基因进行校正。目前关于筛选适合谷子实时荧光定量PCR研究的内参基因的报道相对较少，随着谷子研究的趋热，筛选适用的内参基因愈加重要。 本研究根据转录组数据和已发表的文献，共筛选出8个基因作为候选内参基因。分别对这8个基因在谷子3个不同组织(叶、茎、根)、7个处理时间(1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h)和3种不同的胁迫处理下(低氮、干旱、高盐)谷子中的表达量进行分析。通过geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder共4种内参基因筛选软件分析了所有样品中内参基因的表达稳定性，同时对 Si4g24340、Si6g18640、Si5g32520、Si4g07620、Si5g42690、Si9g37480 构建载体并进行转基因拟南芥和谷子的验证。结果如下: (1)在低氮胁迫条件下，用Si5g32520和Si4g24340标准化转录本，叶中推荐Si5g32520和Si4g24340联合使用，茎中Si6g18640和Si4g24340被认为是稳定性高的选择，根中表现最稳定的是Si5g32520和UBQ。 (2)在干旱胁迫条件下，Si4g24340和Si5g42690为最适内参基因,叶和茎中同样推荐使用Si4g24340和Si5g42690,根中推荐Si6g18640和TUB-α作为内参基因使用。 (3)在盐胁迫条件下，Si4g07620和UBQ是最稳定的内参基因，而根中内参基因的推荐使用组合与此相同，茎中推荐Si4g07620和Si4g24340作为内参基因使用，叶中Si4g24340和Si6g18640为最适内参基因。 (4)综合分析非生物胁迫下的最适内参基因，Si5g42690、Si5g32520和Si4g24340可作为组合内参使用，根中推荐Si9g37480和UBQ为最适内参基因，叶中Si5g32520与Si5g42690的稳定性最好，茎中认为Si5g42690与Si4g24340最好。 (5)对T3代转基因拟南芥和T1代转基因谷子的GUS进行染色，结果表明Si4g07620、Si4g24340、Si5g32520、Si6g18640、Si5g42690、Si9g37480 均有表达，这为进一步研究其作为内参基因的稳定性提供了基础。 本实验通过4种软件分析得到了谷子在干旱、低氮、盐三种非生物胁迫下的最适内参基因，并且对6个候选内参基因进行载体构建，获得了 Si4g07620、Si4g24340、Si5g32520、Si6g18640、Si5g42690、Si9g37480 拟南芥阳性转化株系和 Si9g37480谷子阳性转化株系，对生殖期的转基因植株进行GUS染色，发现Si4g07620、Si4g24340、Si5g32520、Si6g18640、Si5g42690、Si9g37480 均有表达,为进一步研究其稳定性提供了基础。本研究为谷子内参基因的应用提供了理论依据。 收起