摘要: 目的： 淋巴细胞通常被认为是在淋巴器官和血液之间不断循环的，但是在一些非淋巴器官尤其是屏障部位（包括粘膜表面和皮肤中）存在组织驻留的淋巴细胞。目前发现的驻留淋巴细胞主要包括先天性淋巴细胞(ILCs)、非传统的T细胞（例如NKT、MAIT、γδT细... 展开 目的： 淋巴细胞通常被认为是在淋巴器官和血液之间不断循环的，但是在一些非淋巴器官尤其是屏障部位（包括粘膜表面和皮肤中）存在组织驻留的淋巴细胞。目前发现的驻留淋巴细胞主要包括先天性淋巴细胞(ILCs)、非传统的T细胞（例如NKT、MAIT、γδT细胞和CD8αα+IELs）和组织驻留记忆T(TRM)细胞。这些特殊的组织驻留淋巴细胞亚群作为组织感染和损伤的传感器，参与固有免疫和适应性免疫，在屏障组织中发挥重要的抵抗感染和防止组织损伤的作用。 肝脏具有独特的解剖结构，不仅是一个重要的代谢、解毒器官，也是独特的免疫器官。肝脏含有多种非实质细胞群体，包括肝窦内皮细胞、Kupffer细胞、胆管细胞、星状细胞和肝内淋巴细胞，尤其富含NK细胞、NKT细胞和γδT细胞。近年来研究发现，肝脏中存在一群驻留性NK细胞，在表型、功能与发育方面同传统的NK细胞存在巨大差异。而研究表明，相比于脾脏和胸腺等其他器官，肝脏γδT细胞比例较高，并且分泌较高水平的IL-17A。基于肝脏独特的有利于细胞驻留的微环境，我们推测肝脏中含量相对丰富的以分泌IL-17A为主的γδT细胞同驻留NK细胞类似，在肝脏驻留，并且具有不同于常规IL-17A+γδT细胞的特性。为了探讨这些问题，本课题从以下几个层面对肝脏分泌IL-17A的γδT细胞亚群进行了研究。首先，我们发现肝脏CD44hiCD27-γδT细胞以分泌IL-17A为主，并且在肝脏中的比例高于脾脏和胸腺;其次，通过对驻留相关的表型进行检测，发现肝脏CD44hiCD27-γδT细胞高表达某些驻留相关的表型，通过联体小鼠模型，进一步确定了这群细胞具有肝脏驻留的特性;最后，我们探讨了肝脏微环境中促进这群细胞在肝脏驻留的因素和机制。 方法： 1.分离C57BL/6J小鼠肝脏、脾脏、胸腺、小肠及淋巴结内的单个核细胞，流式细胞术检测其中γδT细胞的比例以及IL-17A和IFN-γ的分泌能力。 2.利用CD44和CD27作为分群标记，流式细胞术确定小鼠肝脏、脾脏和胸腺γδT细胞各个亚群的位置和比例，PMA与离子霉素体外刺激，检测细胞因子的分泌。 3.流式细胞术检测成年小鼠肝脏、脾脏和胸腺中CD44hiCD27-和CD44hiCD27+γδT细胞表面驻留相关标记和转录因子的表达。 4.利用联体小鼠模型验证肝脏CD44hiCD27-γδT细胞的组织驻留特性，流式细胞术检测此细胞亚群Vγ型的表达。 5.通过流式细胞术检测肝脏、脾脏和胸腺γδT细胞前体细胞的比例，通过联体小鼠模型验证肝脏γδT前体细胞的组织驻留特性，通过与OP9-DL1共培养实验确定γδT前体细胞向成熟γδT细胞发育分化的能力。 6.流式细胞术检测肝脏CD44hiCD27-γδT细胞Notch1的表达;灌流法分离提取小鼠肝窦内皮细胞，普通PCR检测肝窦内皮细胞Notch配体的表达。 7.流式细胞术检测肝脏CD44hiCD27-γδT细胞趋化因子受体CXCR3和CXCR6的表达;体外培养肝窦内皮细胞，ELISA检测培养上清中CXCR6的配体CXCL16的水平。 8.灌流法分离小鼠肝窦内皮细胞，流式细胞术检测肝窦内皮细胞粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表达;流式细胞术检测肝脏CD44hiCD27-γδT细胞LFA-1和VLA-4的表达。 结果： 1.C57BL/6J小鼠肝脏中存在较高比例的γδT细胞，且分泌较高水平的IL-17A。根据CD44和CD27的表达可以将γδT细胞分为三个不同的亚群，CD44hiCD27-γδT细胞亚群、CD44hiCD27+γδT细胞亚群和CD44lo/-γδT细胞亚群。同脾脏和胸腺相比，肝脏中存在相对较丰富的以分泌IL-17A为主的CD44hiCD27-γδT细胞。 2.肝脏CD44hiCD27-γδT细胞表达较高水平的细胞驻留相关标记CD69和CD49a，而低表达淋巴细胞迁出相关分子CD62L。 3.肝脏CD44hiCD27-γδT细胞高表达IL-17A相关的转录因子RORγt，低表达IFN-γ相关的转录因子T-bet，并且高表达驻留相关转录因子PLZF而低表达Eomes。 4.肝脏CD44hiCD27-γδT细胞具有肝脏驻留的特性。在联体小鼠模型中，发现CD45.1小鼠肝脏中几乎只存在CD45.1+CD44hiCD27-γδT细胞，CD45.2小鼠肝脏中几乎只存在CD45.2+CD44h1CD27-γδT细胞。 5.肝脏驻留特性的CD44hiCD27-γδT细胞可能在肝脏中发育。相对于脾脏来说，肝脏中存在较高比例的CD24hiCD73+γδT前体细胞，通过联体小鼠模型证明这群前体细胞亦具有肝脏驻留特性，通过体外培养发现该群前体细胞能够发育分化为分泌IL-17为主的成熟γδT细胞。 6.相对于脾脏和胸腺来说，肝脏CD44hiCD27-γδT细胞表达较高水平的Notch1受体，肝窦内皮上表达Notch的配体JAG1、DLL1和DLL4，提示Notch信号对于CD44hiCD27γδT细胞在肝脏的发育和驻留可能发挥重要作用。 7.肝脏CD44hiCD27-γδT细胞表达促进淋巴细胞向肝脏归巢的趋化因子受体CXCR6，肝窦内皮细胞分泌其配体CXCL16;肝脏CD44hiCD27-γδT细胞高表达粘附分子LFA-1和VLA-4，肝窦内皮细胞表达它们的受体ICAM-1和VCAM-1，提示肝窦内皮细胞可能通过趋化和黏附作用促进CD44h1CD27-γδT细胞在肝脏的驻留。 结论： 1.肝脏含有较高比例的分泌IL-17A为主的CD44hiCD27-γδT细胞。 2.肝脏CD44hiCD27-γδT细胞表达驻留相关的分子标志，具有肝脏组织驻留的特性。 3.肝脏CD24hiCD73+γδT前体细胞亦具有肝脏组织驻留的特性，且可向成熟γδT细胞发育分化。 4.肝窦内皮细胞在维持CD44hiCD27-γδT细胞在肝脏的发育和驻留中发挥重要作用。 收起