摘要: 纳米技术在肿瘤治疗和成像方面展现出广阔的应用前景。合理利用肿瘤微环境特征，开发智能化纳米药物递送系统，是提高治疗效果、放大成像信号及减少毒副作用的重要途径之一。近年来，光动力以及光热治疗在肿瘤治疗中被广泛关注。增加肿瘤病灶的氧供给... 展开 纳米技术在肿瘤治疗和成像方面展现出广阔的应用前景。合理利用肿瘤微环境特征，开发智能化纳米药物递送系统，是提高治疗效果、放大成像信号及减少毒副作用的重要途径之一。近年来，光动力以及光热治疗在肿瘤治疗中被广泛关注。增加肿瘤病灶的氧供给以及扫除活性氧发挥作用的障碍是光动力治疗亟待解决的难题之一。对于光动力治疗和光热治疗的联合应用，揭示活性氧及热效应共同作用引起细胞死亡的机制是寻找有效的联合治疗手段的前提。本研究，基于二氧化锰包覆的聚乳酸羟基乙酸共聚物纳米粒和无定型介孔磷酸锰纳米材料，设计并构建了三种肿瘤微环境响应式治疗成像系统。三种系统分别基于二氧化锰促进“开源节流”式生成活性氧的功能、吖啶黄对光动力治疗逃逸途径中低氧诱导因子1-α/血管内皮生长因子(HIF-1α/VEGF)信号通路的抑制作用以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂雷帕霉素的多机制抗肿瘤作用，以增强各系统在激光照射下的光动力治疗及其与光热治疗的联合作用。此外，三种系统还具有肿瘤微环境刺激响应的磁共振成像信号放大和治疗药物释放的特性。主要内容如下: 1.“开源节流”式光动力治疗体系用于增强肿瘤光动力治疗和磁共振成像研究 光动力治疗是一种非侵入性的治疗方式，依赖于光敏剂、氧气以及激光刺激。除了借助纳米靶向技术增加光敏剂在肿瘤部位的蓄积外，利用纳米材料与肿瘤微环境之间的相互作用，改善肿瘤氧供给，降低大量耗竭活性氧的还原型谷胱甘肽的水平，进而扫除活性氧发挥作用的障碍，实现“开源节流”式活性氧(ROS)蓄积，对于增强肿瘤光动力治疗具有重要价值。 本课题构建了一种二氧化锰纳米层覆盖的聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米粒，用于增强肿瘤光动力治疗和磁共振成像。首先，制备载光敏剂血卟啉单甲醚(HMME)的PLGA纳米粒(PLGA/HMME)，然后将高锰酸钾还原为二氧化锰覆盖于载光敏剂纳米粒上，形成PLGA/HMME@MnQ纳米粒。该二氧化锰覆盖层能够催化肿瘤微环境中的H2O2生成氧气，有利于HMME在激光下生成更多活性氧，而且二氧化锰可以耗竭还原型谷胱甘肽(GSH)，降低活性氧的消耗，实现ROS的“开源节流”，助力肿瘤光动力治疗。制剂表征显示纳米粒平均粒径约为209.8nm，平均zeta电位为-4.4mV，稳定性良好。光敏剂包载于PLGA后，单线态氧的产生能力不受影响，光敏剂包封率为75.0％。体外释放结果表明，在含谷胱甘肽释放介质中，PLGA/HMME@MnO2在12h的累计释放量为82.0％，而在无谷胱甘肽释放介质中，累计释放量为56.9％。因此，纳米粒表面的二氧化锰纳米层能够减缓HMME释放。通过流式细胞仪定量分析细胞内的ROS含量。HMME+532nm激光组、PLGA/HMME+532nm激光组和PLGA/HMME@MnO2+532nm激光组的阳性细胞百分数分别为14.9％、27.5％和35.8％。与空白组相比，PLGA/HMME@MnO2作用24h后，细胞内GSH水平有所下降。因此，二氧化锰的包覆在ROS的“开源节流”中发挥了关键性作用。体内药物动力学研究表明，PLGA/HME@MnO2纳米制剂的AUC值为115.26μg/(mL·h)，t1/2为15.29h，说明该系统具有体内长循环的效果。药效学实验表明，PLGA/HMME@MnO2+532nm激光组荷瘤小鼠的相对肿瘤体积为1.5±0.4，与HMME+532nm激光组，PLGA/HMME+532nm激光组有显著性差异。哌莫硝唑探针检测肿瘤组织的乏氧情况，结果证实二氧化锰能够改善肿瘤乏氧环境。体内外的磁共振成像结果显示，在模拟肿瘤微环境及肿瘤微环境中，PLGA/HMME@MnQ在0.5T磁场下的弛豫率大于1.0mM-1s-1，能够增强T1加权成像效果。综上所述，该无机有机纳米杂化系统为增强肿瘤光动力治疗和磁共振成像提供了一种新途径。 2.pH超敏感介孔磷酸锰纳米粒用于级联式光动力治疗与磁共振成像研究光动力治疗引起的氧消耗会加重肿瘤的乏氧环境，导致光动力治疗抵抗或者逃逸。低氧诱导因子1α/血管内皮生长因子(HIF-1α/VEGF)信号通路激活与肿瘤乏氧引起的治疗抵抗密切相关。通过一步溶剂水热法制备了无定型的介孔磷酸锰(PMP)纳米粒。由于其具有无定型特征，PMP对pH具有超敏感响应崩解特性，可以实现药物控释，更为重要的是，PMP降解后的锰离子可以增强磁共振成像。PMP的介孔结构有利于光敏剂二氢卟吩(Ce6)和HIF-1α/VEGF信号通路抑制剂吖啶黄(ACF)共包载。通过pH敏感键苯硼酸酯将羧甲基葡聚糖覆盖在纳米粒的表面，形成C-PMP/Ce6/ACF系统。该系统不但可以减少所装载药物在血液循环过程中的泄漏，而且可以实现肿瘤间质微环境刺激响应的苯硼酸功能基团暴露，利于纳米粒和肿瘤细胞表面的唾液酸结合，促进药物转运入胞。 通过3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(APTMS)的氨基化修饰，脂溶性的磷酸锰纳米粒成功的转变为水溶性的纳米粒。研究结果表明，C-PMP/Ce6/ACF纳米粒大小均匀，平均粒径约180.7nm，多分散指数(PDI)约0.21，平均zeta电位约-22.6mV，说明稳定性良好。体外释放结果显示，在pH7.4PBS中，C-PMP/Ce6/ACF在24h内累计释放ACF和Ce6的百分数分别为60.89％和52.70％。在pH6.0PBS中，C-PMP/Ce6/ACF在24h内累计释放ACF和Ce6的百分数分别为89.84％和96.87％。因此，该系统具有明显的pH响应释放特征。C-PMP/Ce6/ACF在pH7.4和6.0条件下的r1弛豫率分别为1.9mM-1s-1和4.8mM-1s-1。细胞凋亡实验表明，在660nm激光作用下，C-PMP/Ce6/ACF对SMMC-7721肿瘤细胞具有明显的生长抑制作用，可诱导细胞产生大量的ROS，促进细胞凋亡，联合治疗组细胞凋亡率高达92.4％。通过qPCR和ELISA实验，也证实了ACF能够下调VEGF mRNA和VEGF的表达。体内实验表明，C-PMP/Ce6和C-PMP/Ce6/ACF组相对肿瘤体积在660nm激光照射下均表现出相对减小的趋势，相对肿瘤体积分别为3.7±0.4和2.7±0.3。磁共振成像结果显示，荷瘤小鼠注射C-PMP/Ce6/ACF制剂后，从冠状面和横断面能够看到肿瘤部位明显白化，和正常组织的区分度明显。总之，C-PMP/Ce6/ACF纳米粒在增强光动力治疗效果，克服治疗逃逸以及肿瘤微环境激活式MRI方面展现了优良性质。 3.共载雷帕霉素和吲哚菁绿的介孔磷酸锰纳米粒用于肿瘤多机制联合治疗研究 鉴于吲哚菁绿(ICG)在激光照射下产生的活性氧(ROS)和热效应引起的自噬潜力，以增加自噬水平为目标的治疗方式和ICG光疗联合具有增强肿瘤治疗效果的潜力。mTOR特异性抑制剂雷帕霉素（RAPA），不但能够降低肿瘤细胞HIF-1α的表达，进而降低VEGF的表达，而且能够促进自噬。ICG水溶液的不稳定性及注射到体内容易在体内快速消除等缺陷限制了其应用。同时，雷帕霉素在水中的溶解度也较低。寻找载药能力强的载体是提高药物稳定性、实现两者联用的有效途径。 本课题将集载药能力高、微酸性响应控释特性与磁共振成像信号放大功能于一体的介孔磷酸锰纳米粒作为RAPA和ICG转运载体，以期实现多机制肿瘤综合治疗。将纳米粒表面化学修饰聚谷氨酸(PGA)，不但提高了载药系统的稳定性，而且能够实现谷氨酰胺转肽酶介导下的内吞入胞。对于MCF-7肿瘤细胞，ICG光疗产生的ROS和热效应诱导显著的自噬性细胞死亡以及细胞凋亡，而RAPA发挥mTOR抑制作用，促进自噬发生及HIF-1α/VEGF信号通路抑制，最终两者通过多机制作用抑制肿瘤生长。 制剂表征表明，系统中ICG和RAPA的包封率分别44.3％和44.0％。由于ICG包封于介孔磷酸锰的孔隙中，并且以无定型状态存在，不但稳定性明显改善，而且光热转换效率也有所提升。在相同浓度下，激光照射3.5min，PGA/PMP/RAPA/ICG的温度升高了18.1℃，ICG的温度升高了10.0℃。蛋白印迹检测表明，ICG光疗和RAPA均能促进自噬标记物LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转变。自噬荧光融合蛋白mCherry-EGFP-LC3示踪、及细胞超微结构的观察和qPCR结果表明，光疗和RAPA联用促进细胞自噬和凋亡发生，进一步揭示了光疗引起MCF-7内ROS蓄积，线粒体膜电位下降等变化，最终通过自噬性细胞死亡、细胞凋亡和抑制HIF-1α/VEGF信号通路发挥抗肿瘤作用。动物实验表明，808nm激光照射注射PGA/PMP/ICG/RAPA的荷瘤小鼠肿瘤部位，照射1.5min，肿瘤部位温度从35.1℃增加到43.2℃。PGA/PMP/ICG/RAPA激光组小鼠的肿瘤体积明显减小，相对肿瘤体积为1.8±0.4。体内实验结果表明，与单纯光疗组相比，PGA/PMP/ICG/RAPA系统下调了肿瘤组织HIF-1α的表达，降低了VEGF的表达量，抑制肿瘤血管生成作用明显。总之，该光疗及mTOR抑制剂RAPA联合治疗系统在提高药物稳定性和肿瘤多机制联合治疗方面优势明显。 收起