摘要: 为了减少猪只患病对畜牧业造成的经济损失，培育出让消费者放心食用的肉类产品，畜牧工作者应该致力于从遗传本质上提高猪对病原的抵抗能力。T淋巴细胞是机体免疫系统抵御并消灭病原体的重要组成成分，其在胸腺中的正常分化发育是机体免疫系统行使正常... 展开 为了减少猪只患病对畜牧业造成的经济损失，培育出让消费者放心食用的肉类产品，畜牧工作者应该致力于从遗传本质上提高猪对病原的抵抗能力。T淋巴细胞是机体免疫系统抵御并消灭病原体的重要组成成分，其在胸腺中的正常分化发育是机体免疫系统行使正常功能的前提条件。此前的大部分研究是基于单个基因或者单个重要通路，鲜少有研究从全基因组的角度来挖掘T淋巴细胞在胸腺中分化发育过程的差异基因表达变化规律。本研究利用流式细胞术分选猪肠系膜淋巴结(L)中CD4-CD8-Double negative cell(DN)和CD4+Single positive cell(CD4SP)和CD8+Single positive cell(CD8SP)各1000个，微量扩增后进行转录组测序，并结合实验室同学前期所做的胸腺(T)组织中四类T细胞的数据进行整合分析，从而得到T淋巴细胞在胸腺中进行TCR(T cell receptor)重排，阳性、阴性选择这一整个生物学过程中的基因表达变化规律。实验结果结果如下: (1)通过单类细胞测序得到肠系膜淋巴结三类T细胞的数据，将肠系膜淋巴结CD4SP(L)与胸腺CD4SP(T)细胞相比，显著上调表达的基因有965个，下调表达的基因有913个;将肠系膜淋巴结CD8SP(L)细胞与胸腺CD8SP(T)细胞相比，显著上调表达的基因有1303个，显著下调表达的基因有1382个;将肠系膜淋巴结DN(L)细胞与胸腺DN(T)细胞相比，显著上调表达的基因有1316个，显著下调表达的基因有1376个;将肠系膜淋巴结CD4SP(L)细胞与CD8SP(L)细胞相比，显著上调表达的基因有46，显著下调表达的基因有137个。 (2)比较DN(T)—DP(Doubel positive)(T)—CD4SP(L)这一发育过程中两组差异基因之间的重叠关系，结果发现共有109个相同基因，其中共同上调了13个基因，分别是BCL7A、CCDC63、ELO VL3、CTNNA1、ETV5等基因。共同下调的基因个数为2，分别是RORA和GSAP。比较DN(T)—DP(T)—CD4SP(T)—CD4SP(L)这一完整发育过程中的三组差异基因之间的重叠关系，结果发现共有18个相同基因，分别是CD8A、ACSS3、PTCRA、MNS1、HHIP等基因，无共同上调、下调基因。 (3)比较DN(T)—DP(T)—CD8SP(L)这一发育过程中两组差异基因之间的重叠关系，结果发现共有120个相同基因，其中共同上调的基因个数为21，分别是GATA3、TNIP3、BCL7A、ELOVL3、LPL等基因。共同下调的基因个数为8，分别是TC2N、RORA、CCL5、GZMK、CD55等基因。比较DN(T)—DP(T)—CD8SP(T)—CD8SP(L)这一完整发育过程中的三组差异基因之间的重叠关系，结果发现共有19个相同基因，分别是CD4、NOTCH3、RAG2、NEB、CLIC2等基因，无共同上调基因，共同下调基因为GSAP。 (4)差异表达基因二维聚类分析将样本成分聚成肠系膜淋巴结和胸腺组织两大类。进一步细分发现肠系膜淋巴结组织中的CD4-CD8-、CD4+、CD8+细胞与胸腺组织中的对应的同类细胞间也可以明显分开，这表明细胞的表达水平发生了显著变化。 (5)差异基因GO富集分析发现，两种组织中CD4、CD8同类单阳细胞之间的差异基因主要富集在适应性免疫反应、T细胞介导的免疫反应、自然杀伤细胞的活化、淋巴细胞活化等生物学过程。两种组织中的双阴细胞的差异基因主要与T细胞活化、淋巴细胞活化、适应性免疫等过程相关，且肠系膜淋巴结组织中的CD4与CD8单阳细胞的差异基因主要富集在淋巴细胞迁移、炎症反应调节、免疫应答中涉及到的细胞因子产生等功能上。 (6)经过时序差异表达分析我们发现在CD4单阳细胞这一条主线上共有1674个差异显著基因;在CD8单阳细胞的这一条主线上，我们共发现了2623个差异显著基因。对其进行功能注释后可知T细胞在发育过程中的差异基因主要与淋巴细胞分化、白细胞分化、T细胞分化等免疫过程相关。 在得到T细胞分化发育过程的差异表达基因后，通过筛选与之相关的关键基因以及重要通路，可以揭示其作用的分子机制，并以此为猪的抗病育种提供一些理论基础。 收起