摘要: α-酮酸具有二羰基结构，是多种生理活性物质的合成中间体，在食品、医药及化工行业应用广泛。生物酶法催化氨基酸制备α-酮酸及其衍生物具有高效、环保和成本低的特点。在催化氨基酸产生α-酮酸的酶类中，膜结合L-氨基酸脱氨酶(mL-AAD)不需要辅酶或氨基... 展开 α-酮酸具有二羰基结构，是多种生理活性物质的合成中间体，在食品、医药及化工行业应用广泛。生物酶法催化氨基酸制备α-酮酸及其衍生物具有高效、环保和成本低的特点。在催化氨基酸产生α-酮酸的酶类中，膜结合L-氨基酸脱氨酶(mL-AAD)不需要辅酶或氨基受体，不会产生对α-酮酸具有氧化破坏作用的过氧化氢，是制备α-酮酸及其衍生物的较为理想用酶。本文以普通变形杆菌（Proteus vulgaris）的mL-AAD为研究对象，优化了分泌表达策略和条件。在此基础上，利用表达mL-AAD的重组工程菌进行了苯丙酮酸(PPA)、3,4-二羟基苯丙酮酸(DHPPA)及相应衍生物苯乳酸(PLA)、丹参素(SAA)的生物制备过程研究。主要结果有: 1.在pET-28a、pET-20b两个质粒中，分别利用mL-AAD自带的tat信号肽（双精氨酸分泌途径）和pelB（保守分泌途径）-tat整合信号肽介导mL-AAD分泌表达，发现采用自身tat信号肽介导mL-AAD分泌的表达方式(BL21(DE3)-pET-28a-mlaad)可以获得更优的菌体生长性能和脱氨活力。 2.以L-苯丙氨酸(L-Phe)为底物，利用工程菌BL21(DE3)-pET-28a-mlaad制备PPA。在优化条件下（pH=8.0，温度37℃，菌体浓度:0.39g/L，L-Phe浓度:150mmol/L），反应42h可得到141mmol/L PPA。在此基础上，利用共表达D-2-羟基异己酸脱氢酶（来自Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus）和甲酸脱氢酶（来自Mycobacterium vaccae N10）的工程菌将制备的PPA转化为PLA，在优化条件下，可得到121mmol/L PLA，综合转化率达到80.7％。 3.以L-多巴(L-Dopa)为底物，利用工程菌BL21(DE3)-pET-28a-mlaad制备DHPPA。在优化条件下（pH=8.5，温度37℃，菌体密度:0.37g/L，L-Dopa浓度:100mmol/L），反应1h可得到28.5mmol/L DHPPA。在此基础上，利用共表达D型乳酸脱氢酶（来自Pediococcus acidilactici DSM20284）和甲酸脱氢酶（来自M.vaccae N10）的工程菌将制各的DHPPA转化为SAA，在优化条件下，可得到11.66mmol/L SAA。 收起