摘要: 当前，我国耕地污染形势严峻，人多地少矛盾冲突。多环芳烃（PAHs）是污染土壤中常见的一类持久性有机污染物(POPs)，具有致畸、致癌、致突变效应。植物可吸收积累土壤中PAHs，并通过生物链传递危害人群健康和生态安全。如何有效地去除污染区植物体内... 展开 当前，我国耕地污染形势严峻，人多地少矛盾冲突。多环芳烃（PAHs）是污染土壤中常见的一类持久性有机污染物(POPs)，具有致畸、致癌、致突变效应。植物可吸收积累土壤中PAHs，并通过生物链传递危害人群健康和生态安全。如何有效地去除污染区植物体内PAHs，以减低植物PAHs污染风险、保障农产品安全、实现污染土壤的资源化利用？该研究备受国际关注。 有研究采用添加外源化学试剂或接种功能微生物来调控植物体内PAHs污染残留。然而，外源化学试剂本身多具有毒性且作用不具广谱性;从土壤等介质中分离的功能微生物对环境要求苛刻、自然调控速度缓慢且往往难以有效地去除植物体内PAHs污染残留。因此，亟需寻找一种简便、有效地方法来规避植物PAHs污染风险。近年来，诸多报道表明植物微生态系统中含有数量和种类丰富的功能内生细菌(EB)，其能定殖在目标植物组织间隙或细胞内部，促进植物生长、提高植物抗性。能否利用植物体内的微生态系统，从污染区植物体内分离、筛选出具有PAHs降解功能的EB，并将其重新定殖在目标植物中，进而有效地去除植物体内PAHs、规避植物污染风险？国内外相关研究仍很薄弱。与从其它环境介质中分离的功能菌对比，从污染区植物体内筛选的具有PAHs降解功能的EB能够更好地适应植物体内环境、有望良好定殖并发挥降解效能。 本论文以菲和芘为PAHs代表物，从PAHs污染区健康植物体内分离、筛选出两株具有PAHs降解功能的EB（BJ06和Ph6），采用选择性抗性标记和绿色荧光蛋白(GFP)基因标记技术，研究了其在目标植物体内定殖分布及植物促生长机理，探讨了接种功能菌株对植物体内PAHs残留和亚细胞分配的影响，揭示了功能菌定殖调控植物体内PAHs的作用机理。研究结果不仅丰富了PAHs降解功能菌菌种库，而且为减低污染区植物体内PAHs污染风险、保障农产品安全、合理利用污染土壤资源等提供了新思路和途径。主要研究结果如下: 1.芘降解功能内生细菌B J06分离筛选及降解条件优化 通过选择性富集培养法，从PAHs污染区健康植物看麦娘（Alopecurus aequalis）体内分离、筛选出一株具有芘降解功能的内生葡萄球菌B J06（Staphylococcus sp.），并系统地研究了该菌的生物学特性及对芘的降解效能。菌株B J06为革兰氏阳性菌，有鞭毛，对氨苄青霉素、卡那霉素和壮观霉素具有较强抗性(＞100 mg·L-1)，其细胞表面最大疏水率为15.8％。菌株BJ06为好氧生长，且能够分别以萘、菲、芘和苯并[α]芘为碳源和能源进行生长繁殖。30℃、150 r·min-1摇床培养15d，该菌对芘的降解效率为56.0％。邻苯二甲酸和邻苯二酚是其代谢芘的典型产物。菌株BJ06降解芘的优化条件为pH6.0-8.0，温度25-35℃，盐浓度0-10 g·L-1，接种密度5-9％，芘初始浓度10-30 mg·L-1。这些结果证实了植物可为PAHs降解功能EB提供一个稳定的生态区位，并丰富了PAHs降解菌菌种库。 2.菌株BJ06的植物促生长特性及定殖效能 采用温室平皿促生试验，探讨了接种菌株B J06对黑麦草（Lolium multiflorumLam.）促生长特性及体内芘降解效能的影响。菌株BJ06可定殖在黑麦草体内，并通过产生吲哚乙酸（IAA)、铁载体及其溶磷机制，促进黑麦草生长、增加黑麦草生物量。在芘污染土壤中，接种菌株B J06促使黑麦草根和茎叶鲜重分别由114.72和289.00mg·pot-1增加至125.39和293.78 mg·pot-1，干重分别由25.72和19.78 mg·pot-1增加至33.89和20.44 mg·pot-1。较高密度的菌株BJ06定殖在黑麦草组织中也能够有效地降低植物体内芘浓度和积累量，并阻控芘由植物根向茎叶传导。与不接菌对比，接种菌株BJ06促使黑麦草根和茎叶中芘浓度分别由78.92和6.31 mg·kg-1减少至54.45和3.52mg·kg-1，积累量分别由2.03和0.13μg·pot-1减少至1.85和0.07μg·pot-1。这些结果表明功能EB不仅能够用于促进植物生长、提高植物生物量，也可用于调控植物体内PAHs污染残留。 3.菲降解功能内生细菌Ph6分离筛选、GFP基因标记及定殖效能 从PAHs污染植物三叶草（Trifolium pratense L.)体内获得一株具有菲降解功能的内生假单胞菌Ph6（Pseudomonas sp.)。采用GFP基因标记技术，追踪了菌株Ph6-gfp在植物体内定殖分布，揭示了其对植物体内菲降解效能的影响。结果表明，质粒pBBRGFP-45能够成功导入野生菌株Ph6体内并稳定表达，且GFP基因的插入没有明显改变菌株Ph6菌落形态、生长特性及对菲的降解效能。摇床培养15d，野生菌株Ph6和标记菌株Ph6-gfp对菲的降解效率均高达80％以上。水杨酸和邻苯二酚是该菌代谢菲的典型产物。此外，菌株Ph6-gfp能够有效地定殖在黑麦草根中，并随植物蒸腾拉力作用迁移到茎叶(P＜0.01)。与不接菌对比，接种菌株Ph6-gfp分别降低了黑麦草根和茎叶中18.5-23.3％和30.4-81.1％菲浓度，10.3-17.6％和30.8-66.5％菲积累量。同时，接种菌株Ph6-gfp也能够减低黑麦草体内菲的传导效能，阻控植物地上部位菲的污染残留。由此可见，植物-功能EB的微生态系统有望作为一种新型的绿色环保技术用于规避植物体内PAHs污染风险。 4.不同定殖方式下菌株Ph6-gfp在植物体内定殖及效能 采用游动平板和结晶紫染色法，研究了菌株Ph6-gfp生长应答反应和细菌成膜能力;通过半封闭系统比较了不同定殖方法对菌株Ph6-gfp在植物体内定殖分布及降解效能的影响。菌株Ph6-gfp对黑麦草主要根系分泌物草酸(OA)和苹果酸(MA)县有明显的生长应答反应，且其培养48 h内能够形成致密的细菌生物膜，表明该菌是黑麦草根表有效定殖者。不同定殖方式可以影响菌株Ph6-gfp在黑麦草体内定殖活性及其对菲的降解效能。与不接菌对比，采用浸种(SS)、浸根(RS)和涂叶(LP)3种定殖方法接种菌株Ph6-gfp后，黑麦草体内菲的总积累量分别降低了20.1％、33.1％和7.1％。其中RS对黑麦草体内菲的去除效率占3种定殖方式总去除效率54.9％。分析原因主要是由于采用RS接种菌株Ph6-gfp后，该菌在黑麦草体内定殖数量和活性均显著地高于SS和LP。由此可见，RS是一种最优的接种方式，可用于显著地阻控植物菲污染风险。然而，实际应用中应考虑多种定殖方法相结合，从而最大限度的减低植物体内PAHs污染残留。 5.接种菌株Ph6-gfp对植物体内菲亚细胞分配和代谢产物分布的影响 接种功能EB能否减低食用农作物体内PAHs污染残留备受国际关注。本研究采用体外和体内降解试验，首次在亚细胞水平揭示了接种菌株Ph6-gfp对小白菜（Brassicachinensis L.）体内菲亚细胞分配的影响，并利用高分辨质谱（HRMS）结合同位素标记技术，阐明了功能内生定殖调控小白菜体内菲的代谢产物分布。结果表明，菌株Ph6-gfp主要定殖在小白菜细胞间隙(IS)和维管束导管中，通过降解或截留作用阻控其溶液中菲向细胞壁(CW)、细胞膜(CM)、细胞液(CS)和细胞器(CO)的传输和分配，进而减低小白菜亚细胞微区中菲含量。HRMS结合同位素此例证实小白菜体内菲的降解和转化机理主要包括3种途径，即功能内生降解、植物代谢和共价绑定。此外，接种菌株Ph6-gf也能够增强小白菜体内菲的功能团化，促进菲的活性官能团化合物和小白菜体内内源性有机物（如葡萄糖和氨基酸等）通过共价绑定作用形成交叉耦合产物。 综上所述，功能EB不仅能在植物体外降解PAHs，在植物体内也具有类似效果。因此，从PHAs污染区健康植物体内分离、筛选出具有PAHs降解功能的EB，并将其重新定殖在目标植物中，可以调控植物体内PAHs降解和亚细胞分配，并有望解决植物PAHs污染残留问题。该研究结果为利用植物-功能EB的微生态系统规避植物体内PAHs污染风险、保障农产品安全和人群健康提供了新思路和途径。 收起