摘要: 目的：本研究旨在探索新型法医分子斑痕标记及其检测技术。首先建立一种简便快速的基因组甲基化可变位点(Methylation variable position,MVP)分析技术--快速甲基化敏感性限制酶消化后PCR链融解曲线法(post fast-methylation sensitive restrictionen... 展开 目的：本研究旨在探索新型法医分子斑痕标记及其检测技术。首先建立一种简便快速的基因组甲基化可变位点(Methylation variable position,MVP)分析技术--快速甲基化敏感性限制酶消化后PCR链融解曲线法(post fast-methylation sensitive restrictionenzymedigestion PCR melting curve analysis,PDP-MCA)，然后用该技术调查一组织特异性 MVP在法医学常见斑痕中的甲基化状态，评价其作为斑痕标记的可行性。 方法：PDP-MCA技术的建立与评价：以文献报道的差异甲基化区(differentially methylated region,DMR)为模型，在MVP位点两侧设计一组产物Tm值各不相同的引物。在同一反应管内，顺次进行基因组 DNA的 Fastdigest MSRE酶切、复合扩增和链溶解曲线分析，Rotor-Gene2.0.2.4软件分析数据生成MCA图谱，Origin8软件进行峰参数计算和统计分析，根据各片段融链峰的面积和峰高比例判断相应 MVP位点的甲基化水平。同时用 PDP-MCA和传统的MSRE-PCR技术检测相同的样品，验证方法的可行性。组织特异性MVP作为法医斑痕标记的可行性：用上述 PDP-MCA技术调查法医学常见斑痕(血斑、唾液斑、精斑各20份，月经血斑、阴道液斑各12份)MVP位点的甲基化状态，分析比较不同斑痕的 MCA/HRM图谱，提取每个片段解链前后的标准荧光变化值，用StatistiXL软件对样本数据进行判别分析，初步确立各种斑痕的判别方程。 结果：(1) Tm值相差2℃以上的4个片段，复合扩增、复合MCA分析可以生成分离良好的融链峰，链融解曲线法可以代替电泳实现快速闭管检测。利用甲基化敏感性的 FastDigest内切酶，可以在同一反应管内实现快速酶切、扩增和MCA检测，不同细胞有不同的MCA图谱。与对照管相比较，组成酶切管MCA图谱的各 MVP峰位置不变，峰高峰面积等参数呈组织特异性变化。这种变化与传统的 MSRE-PCR得到的结果一致，所反映的组织细胞甲基化特征也与文献报道相符。当前实验条件下，0.5 ng的基因组 DNA即可获得稳定的 MCA图谱。加入的基因组DNA在0.5~20 ng之间，不影响图谱的特异性。(2)用PDP-MCA检测，血斑、唾液斑、精斑、月经血斑、阴道液斑各有其特异性的 MCA图谱， HRM差异曲线可以直观的分出男性生殖斑痕(精斑)、女性生殖斑痕(月经血斑和阴道液斑)、非生殖斑痕三大类。对样本数据进行判别分析，得到6个判别方程：Y血＝215.889X1＋351.518X2＋184.426X3＋187.220X4－8944.600， Y唾液＝218.104X1＋357.846X2＋185.441 X3＋189.631X4－9160.218，Y精液＝211.353 X1＋336.697X2＋181.563X3＋182.828X4－8479.036，Y阴道液＝212.469X1＋348.672X2＋180.079X3＋189.103X4－8702.051， Y月经血＝214.026X1＋349.480X2＋182.364X3＋189.059X4－8812.421, Y对照＝209.004X1＋337.309X2＋178.322X3＋187.022X4－8367.215。训练样本的总体判别准确率为97.2%，除血斑(83.3%)外，其他斑痕的准确率均为100%。 结论：(1) PDP-MCA可以实现多个 MVP的一步单管、闭管检测，是一种简便快速的 DNA甲基化分析技术；(2)所调查的5个 MVP片段(MAGE1、14-3-3σ、MCJ、TIMP、HOXA5)在常见法医斑痕之间存在甲基化差异，可以作为候选的分子斑痕标记；(3)用 PDP-MCA联合检测 MAGE1、14-3-3σ、MCJ三个MVP片段，可以鉴别血斑、精斑、唾液斑、月经血斑及阴道液斑。 收起