摘要: 研究目的： （1）研究生物活性脂类及其类似物对γ-分泌酶的活性调控作用，以期筛选出抑制效果较好的γ-分泌酶抑制剂（γ-secretase inhibitor，GSI），并初步探讨其作用机制，为阿尔茨海默症（Alzheime's disease，AD）的新型药物治疗提供实验基础；... 展开 研究目的： （1）研究生物活性脂类及其类似物对γ-分泌酶的活性调控作用，以期筛选出抑制效果较好的γ-分泌酶抑制剂（γ-secretase inhibitor，GSI），并初步探讨其作用机制，为阿尔茨海默症（Alzheime's disease，AD）的新型药物治疗提供实验基础； （2）通过研究γ-分泌酶对新底物AXL的剪切作用，确定其对AXL的剪切位点，为γ-分泌酶的剪切机制以及确定AXL剪切产物提供理论基础； 研究方法： （1）体外表达并纯化γ-分泌酶的底物C100（APP截短形式）、N100（Notch的截短形式）；表达γ-分泌酶的四个亚基，并提取γ-分泌酶纯酶； （2）建立γ-分泌酶体外酶切模型，通过剪切产物AICD/NICD的积累量来判断γ-分泌酶的活力； （3）测试脂类物质ETI对γ-分泌酶的调节作用，Western blot检测剪切产物AICD/NICD的表达量；Wiltfang blot检测Aβ40、Aβ42的表达量； （4）采用磷脂竞争实验及分子模拟初步阐述ETI对γ-分泌酶的作用机制； （5）设计引物并进行PCR，将野生型AXL跨膜区中相应位置的氨基酸进行定点突变，经过抗性筛选出单克隆，扩大培养并提取质粒后进行DNA测序，确定突变成功； （6）将突变后的AXL质粒转染到HEK293T细胞中，加入γ-分泌酶抑制剂处理过夜，裂解细胞，用Western blot检测底物CTF的积累情况，间接判断γ-分泌酶对AXL的剪切作用。 实验结果： （1）以pET-21b为载体，成功提取了γ-分泌酶相关底物N100、C100；培养稳转了γ-分泌酶PS1、PEN2-Flag、Aph1-HA、NCT-V5/His四个亚基的S20细胞，并提取了γ-分泌酶； （2）通过体外酶活测试发现了一种长链脂肪酸类似物二十碳三炔酸（5，8，11-Eicosatriynoic acid，ETI）对γ-分泌酶具有抑制作用，并在细胞水平验证其对γ-分泌酶同样具有抑制效果； （3）探讨了以底物N100、C100为研究对象时ETI对γ-分泌酶的作用效果。发现以C100为底物时，ETI对γ-分泌酶的抑制效果明显，而以N100为底物时，ETI对γ-分泌酶的活性没有影响； （4）磷脂竞争实验表明高浓度的磷脂分子能够减弱或抵消ETI对γ-分泌酶的抑制作用，而低浓度的磷脂分子不能影响ETI对γ-分泌酶的抑制作用；通过分子模拟，预测了ETI与γ-分泌酶相互作用机制，发现ETI与γ-分泌酶亚基存在结合位点； （5）AXL跨膜区单个氨基酸突变或缺失后γ-分泌酶对底物AXL依然发挥剪切作用；AXL跨膜区靠近胞内的6个氨基酸突变后γ-分泌酶对底物AXL依然发挥剪切作用；当靠近胞外的前8个氨基酸和靠近胞内的后6个氨基酸均突变后，γ-分泌酶对底物AXL不能发挥剪切作用；而仅对AXL跨膜区靠近胞外的前8个氨基酸突变，γ-分泌酶对底物AXL仍不能发挥剪切作用； （6）仅突变跨膜区上述前8个氨基酸中的前4个或者后4个氨基酸后，γ-分泌酶依然能够对底物AXL进行剪切。 结论： （1）一种含有20个碳原子及3个碳碳三键的长链脂肪酸类似物二十碳三炔酸（5，8，11-Eicosatriynoic acid，ETI）对γ-分泌酶有选择性抑制作用，并能同时抑制γ-分泌酶剪切产物Aβ40、Aβ42的产生。ETI可能通过置换γ-分泌酶复合物中的两个磷脂分子而抑制其酶活力； （2）γ-分泌酶能够识别并剪切底物AXL，其剪切位点位于AXL跨膜区靠近胞外的前8个氨基酸，且剪切位点有多个。 收起