摘要: 背景及目的： 近年来国人饮食结构和生活方式的改变导致代谢综合征（Metabolic Syndrome，MS）和非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的发病率逐年上升，严重影响国人健康。肝脏脂肪代谢紊乱是导致MS和NAFLD发生和发展... 展开 背景及目的： 近年来国人饮食结构和生活方式的改变导致代谢综合征（Metabolic Syndrome，MS）和非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的发病率逐年上升，严重影响国人健康。肝脏脂肪代谢紊乱是导致MS和NAFLD发生和发展的核心机制。因此，阐明肝脏脂肪代谢紊乱的病理机制和寻找干预靶点是当今医学界的重大难题。本课题组前期研究发现去乙酰化酶家族最重要的成员沉默信息调节因子1（Silent information regulator1，SIRT1）在人肝脏脂肪变细胞中表达明显下降，而SIRT1肝脏特异性敲除可引起明显的肝脏脂肪变和糖异生障碍。以上结果提示SIRT1对肝脏糖脂代谢关键蛋白的去乙酰化调控，并在脂质代谢障碍中发挥尤为关键的作用。此外，SIRT1还可通过与众多脂肪代谢的转录因子的相互作用，如PPARγ、PGC-1α、FOXO等调控脂肪代谢。目前在能量代谢领域，对肝脏脂肪代谢通路及相关分子的研究大多延续了30年前甚至更早发现的经典分子，相关新分子发现及鉴定研究较为薄弱。在蛋白质组学和功能基因组学日益成熟的今天，我们有条件和必要利用新的技术和手段探索肝脏脂肪代谢通路新的关键分子与通路。因此，本课题将聚焦 SIRT1与肝脏脂肪代谢的关系，旨在寻找能够影响脂肪代谢的新的关键蛋白。我们的研究可能为MS及NAFLD的治疗提供重要的理论和潜在临床应用价值。 方法： 1、构建两种不同的肝脏脂肪变小鼠模型：肝脏特异性SIRT1敲除小鼠（SIRT1-LKO）和高脂饮食（HFD）喂养小鼠。通过qPCR、Western-Blot、免疫组化、HE染色等方法确认模型构建。 2、将实验小鼠分为四组：CONTROL组，SIRT1-LKO组，HFD组，SIRT1-LKO＋HFD组。运用iTRAQ-MS/MS和cDNA array技术分别筛选SIRT1相关差异蛋白和基因并锁定兴趣分子 CRT。qRT-PCR和Western-Blot进行小鼠肝脏组织样本中CRT表达验证。 3、CRT功能验证。构建CRT过表达及RNA干扰慢病毒载体，并分别转入人胚胎肝细胞系（L02）及过表达SIRT1的L02细胞（L02-SIRT1）中。qRT-PCR和Western-Blot验证CRT表达情况。建立油酸（oleic acid，OA）和棕榈酸（palmitic acid，PA）刺激细胞脂肪变模型。高内涵筛选系统检测 CRT的表达和脂肪合成的关系。qRT-PCR检测CRT高、低表达L02细胞系中FAS、SCD、ChREBP、PPARα等糖脂代谢相关基因的表达情况。在同时过表达CRT和SIRT1的L02细胞（L02-SIRT1-CRT）中以免疫共沉淀法（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）检测SIRT1和CRT之间是否存在蛋白间相互作用。 结果： 1、成功构建两种不同的肝脏脂肪变小鼠模型。我们证实了SIRT1-LKO小鼠中SIRT1肝脏特异性缺如。HE染色显示SIRT1-LKO小鼠和HFD喂养小鼠均呈现肝脏组织明显脂肪变。 2、通过iTRAQ-MS/MS技术和cDNA array筛选出兴趣蛋白CRT，CRT的mRNA水平不变而蛋白水平升高提示其可能受到蛋白翻译后修饰。iTRAQ结果显示与CONTROL组相比CRT蛋白在SIRT1-LKO组及HFD组分别升高1.49和1.18倍，在SIRT1-LKO＋HFD组升高1.62倍。Western-Blot检测发现SIRT1-LKO组及HFD组小鼠肝脏组织中CRT蛋白水平也升高，与iTRAQ结果相一致。cDNA array结果显示CRT mRNA水平在SIRT1-LKO及HFD情况下均未发生明显差异，qRT-PCR提示同一结果。 3、在CRT高、低表达的L02细胞系中验证CRT对脂肪合成的影响。构建CRT过表达和RNA干扰慢病毒载体并经双酶切电泳及DNA测序验证。qRT-PCR和Western-Blot证实CRT过表达及低表达细胞系构建成功。油红O和BODIPY染色证实OA和PA成功诱导脂肪变细胞模型。高内涵检测提示CRT过表达能够抑制脂肪合成，而CRT低表达使细胞中脂滴合成增加。qRT-PCR结果显示FAS、ChREBP等促进脂肪合成的基因在CRT高表达细胞系中降低，而在CRT低表达时升高。Co-IP结果提示SIRT1和CRT之间存在蛋白间相互作用。 结论： 1、成功构建两种不同的NAFLD小鼠模型。SIRT1-LKO小鼠呈现明显的肝脏脂肪变，证实SIRT1可以抑制脂肪合成，与前期研究结果一致。 2、小鼠肝脏组织中CRT蛋白在SIRT1-LKO及HFD组升高而mRNA水平不变，提示CRT蛋白水平变化可能是由于蛋白翻译后修饰所致。 3、成功构建CRT过表达及RNA干扰慢病毒载体及相应细胞系。细胞系中脂滴含量检测提示CRT能够抑制脂肪合成和FAS、ChREBP等促进脂肪合成基因的表达。Co-IP提示SIRT1和CRT之间存在蛋白间相互作用。以上结果强烈提示CRT可能是SIRT1去乙酰化底物分子。 收起