摘要: 梭梭（Haloxylon ammodendron）是一种在沙地中生长的防风固沙植物，具有非常强的抗逆特性。目前人们对梭梭的研究已逐渐从其生态学与生物学方面转向分子水平，但是对于其分子水平的研究还比较落后。要研究梭梭的生长发育和抗逆分子调控机制，就必须要... 展开 梭梭（Haloxylon ammodendron）是一种在沙地中生长的防风固沙植物，具有非常强的抗逆特性。目前人们对梭梭的研究已逐渐从其生态学与生物学方面转向分子水平，但是对于其分子水平的研究还比较落后。要研究梭梭的生长发育和抗逆分子调控机制，就必须要有相应条件下表达稳定的内参基因作为参照，因此研究不同内参基因在不同条件下的表达稳定性，从而针对不同逆境条件筛选合适的内参基因，同时建立优化的实时定量表达体系，对研究梭梭的逆境分子机制具有重要的理论和现实意义。本研究根据梭梭转录组测序结果分析所得内参基因的部分序列设计荧光定量PCR引物，利用半定量及荧光定量PCR分析了梭梭不同组织及不同逆境胁迫下的内参基因的表达情况。具体的研究如下: (1)根据梭梭的转录组测序结果，分析了多条内参基因，最终筛选出了其中的8条内参基因作为研究对象，并根据拼接得到的核酸序列设计引物克隆内参基因序列。将所克隆的梭梭各内参基因与其他植物对应的内参基因进行同源性比对，发现它们与其它植物对应的内参基因的相似性均在80％以上，说明所选取的梭梭这8条内参基因具有高度的保守性，符合对内参基因选取的基本要求。并在此研究基础上，获得了HaACT1和HaACT2全长cDNA和基因组DNA序列。本研究作为梭梭内参基因的基础性研究，为后续实验提供了比较准确的数据信息，同时也为梭梭中其他内参基因的全长cDNA序列和基因组DNA序列的获得奠定了基础。 (2)对选取的梭梭8个内参基因设计荧光定量PCR引物，以不同基因的质粒标准品为模板，按10倍系列稀释为8个浓度梯度，建立了实时荧光定量PCR反应最优化体系。以实验所得的各质粒稀释品的Ct值为纵坐标、以不同质粒浓度拷贝数的对数为横坐标绘制标准曲线。结果表明，梭梭各内参基因的标准曲线较为理想，线性关系较好，可用于后续实验数据的分析。 (3)对梭梭内参基因在不同组织中的表达量进行半定量PCR分析。结果表明，这8个内参基因在梭梭同化枝、花、根、种子中均能够表达。对各种非生物胁迫下的梭梭各内参基因进行绝对荧光定量PCR实验，并运用生物统计学软件geNorm、BestKeeper、NormFinder综合分析了不同逆境胁迫下内参基因表达稳定性。结果表明，干旱胁迫、高温胁迫、高盐胁迫、低温胁迫及伤害胁下，梭梭最适内参基因分别为:Ha18SrRNA、Ha TUA5及HaUBQ10; Ha18SrRNA和HaGAPDH; HaACT7和HaUBQ10; HaACT1和HaTUA5; HaTUA5和HaGAPDH。 收起