摘要: 近年来，随着人们对组织工程及细胞治疗领域关注度的提升，骨髓间充质干细胞(BMSCs)已成为研究的焦点之一。BMSCs是属于骨髓来源的非造血干细胞，具有诸多生物学特性，如来源广泛并易于分离扩增、低免疫源性且不易引起免疫损伤、作为“种子”细胞具有多... 展开 近年来，随着人们对组织工程及细胞治疗领域关注度的提升，骨髓间充质干细胞(BMSCs)已成为研究的焦点之一。BMSCs是属于骨髓来源的非造血干细胞，具有诸多生物学特性，如来源广泛并易于分离扩增、低免疫源性且不易引起免疫损伤、作为“种子”细胞具有多向分化能力、可分泌多种细胞因子并通过自分泌或旁分泌功能影响自体或其他细胞多种生物学功能并可调节炎性反应等。BMSCs应用于心血管疾病已有大量的基础及临床研究报道。研究显示，BMSCs可以增加梗死心肌局部血流量及毛细血管密度，缩小梗死心肌面积，并在梗死心肌内发现了存活的移植细胞。也有实验发现，BMSCs可被招募到损伤的血管部位并分化为内皮细胞及平滑肌细胞，同时对损伤血管进行修复。而BMSCs通过分泌细胞因子刺激血管新生、发挥抗炎作用、诱导其迁移至损伤组织并参与损伤组织的修复也有大量研究报道。 动脉粥样硬化(AS)为多发病，其发生机制不清，可能与多因素、多发病环节密切相关。众多学者认为，动脉粥样硬化病变的发生是动脉对血管内皮、内膜损伤做出的炎症—纤维增生性反应。而BMSCs的生物学特性，使其为AS临床应用提供可能性。 “痰瘀同治”方药的主要成分为红曲、瓜萎、薤白和三七，此前我们实验小组已经对其进行了动物急性毒理实验和对动脉粥样硬化影响的实验研究。结果表明，“痰瘀同治”方药可以明显降低血脂水平、稳定斑块，抑制动脉粥样硬化的进展且安全无毒性作用。本实验拟观察“痰瘀同治”方药对BMSCs增殖、凋亡、迁移等方面的影响，为“痰瘀同治”方药与BMSCs联合应用治疗AS提供理论基础。 目的： 体外实验观察“痰瘀同治”方药对大鼠BMSCs增殖、凋亡、迁移及分泌血管内皮生长因子(VEGF)的影响，并初步探讨BMSCs迁移的可能机制。 方法： 取4周龄SD大鼠，分离其后肢胫骨和股骨，提取全骨髓细胞。采用全骨髓贴壁法分离并培养大鼠BMSCs，培养过程中应用倒置显微镜观察细胞形态。取培养纯化至第3代后的BMSCs进行鉴定:对培养细胞进行形态学观察;流式细胞仪检测BMSCs表面标志物CD29、CD90，CD34、CD45阳性表达率;分别用成脂和成骨培养基定向诱导BMSCs分化，并用油红O及茜素红染色鉴定分化后的细胞。用20mlDMSO将10mg“痰瘀同治”方药完全溶解，完全培养基将其浓度稀释为10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L、150μg/L，并相应分为10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L、150μg/L药物组及对照组。用不同浓度“痰瘀同治”方药与生长良好的第3代BMSCs分别干预培养12h、24h、36h、48h、60h、72h，应用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测各组BMSCs的增殖情况，并筛选出最适药物作用浓度及时间。应用流式细胞技术及transwell小室检测不同药物浓度在最适培养时间点时BMSCs的凋亡情况及BMSCs的迁移能力。在最适浓度及时间点干预培养第3代BMSCs，应用Western Blot检测CXCR4蛋白的表达。ELISA法检测不同干预浓度培养的BMSCs在最适培养时间VEGF分泌水平。 结果： 1.大鼠BMSCs的形态学观察及鉴定全骨髓贴壁方法所获得的BMSCs培养14～21日即可传代，传代后增殖速度较原代明显增快，7d左右可融合达80％。第3至第6代细胞纯化程度高，细胞增殖能力强;传代后培养的BMSCs呈纺锤形或多角形，细胞数目多、排列紧密时可呈漩涡状排列。经流式细胞仪检测，培养的BMSCs均一表达CD29、CD90，阳性率分别为98.23％、98.69％;而CD34、CD45，阳性表达率分别为2.47％、1.94％;成脂诱导培养基诱导培养BMSCs后，观察到脂滴被红染的细胞;成骨诱导培养基诱导培养BMSCs后，可见红色矿化结节。上述结果均符合BMSCs的鉴定特征。 2.“痰瘀同治”方药对BMSCs增殖及凋亡的影响以不同浓度“痰瘀同治”方药与BMSCs共培养后，根据不同时间点测定的OD值绘制增殖曲线。与对照组曲线比较，曲线上药物浓度为10ug/L、25ug/L及50ug/L有增殖效果，曲线下药物浓度为100ug/L及150ug/L组抑制增殖。在药物浓度为50ug/L而培养时间为24h、36h、48h、60h、72h，25ug/L培养时间在48h、60h、72h，10ug/L培养时间在60h、72h时，细胞生存率均明显高于同时间点对照组，其差异均有统计学意义，P＜0.05;而50ug/L药物组自36h后各时间点细胞生存率均显著高于同时间点的10ug/L和25ug/L药物浓度组，差异有统计学意义，P＜0.05。经流式细胞仪检测，当“痰瘀同治”方药内容物溶解液与BMSCs共培养48h后，药物浓度为25μg/L、50μg/L时对BMSCs凋亡有显著抑制作用，与对照组比较差异均有统计学意义，P＜0.05。 3.“痰瘀同治”方药对BMSCs迁移的影响“痰瘀同治”方药药物浓度10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L干预培养BMSCs48h，与对照组比较，各浓度药物组迁移细胞数目均明显多于对照组(P＜0.05)，其中药物浓度为50μg/L时对BMSCs的迁移促进作用最为显著。Western blot结果显示，各实验组CXCR4蛋白表达均有少量的增加，与对照组比较，50μg/L药物干预组CXCR4蛋白表达量增高明显，差异有统计学意义，P＜0.05。 4.“痰瘀同治”方药对BMSCs分泌VEGF的影响当“痰瘀同治”方药浓度为25μg/L、50μg/L，培养时间为48h时，BMSCs培养上清液中VEGF浓度分别为（406.22±10.71）pg/ml、（410.44±12.15）pg/ml，与对照组（387.56±10.25）pg/ml比较明显增高，差异有统计学意义(P＜0.05)。 结论： “痰瘀同治”方药可促进大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的增殖，抑制其凋亡，促进血管内皮生长因子的分泌，并可能通过促进CXCR4的表达而促进BMSCs的迁移。 收起