摘要: 丝氨酸消旋酶是一种双功能酶，拥有消旋酶和脱水酶的作用，不仅能催化L-型和D-丝氨酸的相互转化，还能将L-/D-丝氨酸转化成丙酮酸。本研究利用玉米丝氨酸消旋酶基因，通过农杆菌介导法对烟草叶片及愈伤组织进行遗传转化，同时用GUS基因导入烟草中作为... 展开 丝氨酸消旋酶是一种双功能酶，拥有消旋酶和脱水酶的作用，不仅能催化L-型和D-丝氨酸的相互转化，还能将L-/D-丝氨酸转化成丙酮酸。本研究利用玉米丝氨酸消旋酶基因，通过农杆菌介导法对烟草叶片及愈伤组织进行遗传转化，同时用GUS基因导入烟草中作为对照，对比玉米丝氨酸消旋酶和GUS基因在叶片及愈伤组织的转化效果，为ZmSR作为新型无抗性筛选标记奠定基础。本研究获得了以下结果： 1、根据玉米丝氨酸消旋酶预测基因（NM_001143028.1）的登录号在NCBI上进行搜索，得知玉米丝氨酸消旋酶基因的片段大小为1303 bp。对重组质粒pCAMBIA1301-ZmSR，用Nco I和BstPⅠ进行双酶切验证，酶切产物电泳检测得到ZmSR和pCAMBIA1301载体两个大小的片段，初步证明ZmSR基因连接到pBI1301载体上。对载体pBI1301-ZmSR进行测序分析，测序结果与NCBI网站上所给出的ZmSR基因的序列完全一致。 2、制备根癌农杆菌LBA4404感受态细胞，并用液氮冻融法将pBI1301-ZmSR质粒导入到LBA4404感受态细胞中。从农杆菌中提取质粒，进一步酶切验证重组质粒pBI1301-ZmSR，结果仍得到ZmSR和pCAMBIA1301载体两个大小的片段。根据玉米丝氨酸消旋酶预测基因序列设计引物，对新提取的农杆菌pBI1301-ZmSR质粒与pBI1301-ZmSR原始质粒进行PCR验证，扩增出了玉米丝氨酸消旋酶基因的阳性克隆，证明了重组质粒已成功导入农杆菌中，可以用来进行遗传转化。 3、通过对烟草培养基条件的筛选，优化了烟草叶片最佳诱导愈伤的培养基为：MS+6-BA0.5 mg/L+NAA2.0 mg/L+蔗糖25 g/L+琼脂6 g/L。该培养基的诱导愈伤的诱导率为100%，并且速度最快，愈伤增殖的效果最好。 4、本研究以质粒pBI1301-ZmSR为目的基因，以质粒pBI121-GUS作为对照，分别用D-丝氨酸和Kan作为筛选试剂，对未转化植株进行Kan和D-丝氨酸抗性临界浓度的筛选。对烟草叶片进行卡那霉素及D-丝氨酸的抗性敏感性试验，分别确定临界浓度为50 mg/L和12 mM。对烟草愈伤组织进行卡那霉素及D-丝氨酸的抗性敏感性试验，分别确定烟草愈伤组织的临界浓度为30 mg/L和6 mM。 5、用农杆菌介导法将pBI1301-ZmSR和pBI121-GUS分别转入到烟草叶片和愈伤组织中，经分子检测由叶片筛选获得的pBI1301-ZmSR抗性苗有3株为阳性植株，由愈伤组织获得的抗性苗有6株为阳性植株。 收起