摘要: 本论文采用RT-PCR法，从毛竹中克隆了捕光叶绿素a/b结合蛋白基因LhcaPe01(GenBank EU035496)；LhcaPe02(GenBank EU121593)；LhcaPe03(GenBank EU366147)；LhcaPe04(GenBank EU366146)的全长。运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列进行... 展开 本论文采用RT-PCR法，从毛竹中克隆了捕光叶绿素a/b结合蛋白基因LhcaPe01(GenBank EU035496)；LhcaPe02(GenBank EU121593)；LhcaPe03(GenBank EU366147)；LhcaPe04(GenBank EU366146)的全长。运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列进行分析以及蛋白结构进行预测。为了解析毛竹PSI四条基因的功能，对毛竹进行了不同光照强度的处理，根据荧光参数的变化判断胁迫程度采集叶片，进行荧光实时定量PCR，选用GAPDH和β-actin作为内参基因，正常光照的叶片作为对照，采用最大二阶导数(2-ΔΔCt)的方法进行Lhca基因的相对定量，此外对同一时期不同组织Lhca四条基因的表达进行相对定量。本论文QRT-PCR采用SYBR-GreenⅠ嵌合荧光与熔解曲线结合法检测Lhca基因家族成员。本论文得出如下结论： (1) LhcaPe01基因cDNA全长为1051 bp，序列从第39 bp开始到第779 bp含有1个开放阅读框和一个中止密码子，编码246个氨基酸。在5′端有38 bp的非编码区，在3′端含有242 bp的非编码区和Poly(A)30 bp。此外，通过DNASTAR软件预测，LhcaPe01编码的蛋白质等电点和分子量分别为5.4000和22107.34Da。通过ExPASy网站对序列进行分析得出：核酸序列中与光合相关的信号区有2个4Fe-4S铁还原氧化蛋白的信号区和2个2Fe-2S铁还原氧化蛋白的信号区。该基因编码的氨基酸序列含有3个蛋白激酶C磷酸化位点；2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点；5个N－肉豆蔻酰位点；2个叶绿素a/b结合蛋白位点。 (2) LhcaPe02基因cDNA全长为1100 bp，序列从第74bp开始到第862bp含有1个开放阅读框和一个中止密码子，编码262个氨基酸。在5′端有73 bp的非编码区，在3′端含有234 bp的非编码区和Poly(A)14bp。LhcaPe02编码的蛋白质等电点和分子量分别为6.14和28095.11 Da。该基因序列含有2个4Fe-4S铁还原氧化蛋白的信号区，推导的氨基酸序列中含有氨基化合物位点为、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N－肉豆蔻酰位点和叶绿素a/b结合蛋白位点。 (3)LhcaPe03基因cDNA全长为1149 bp，序列从第76 bp开始到第861 bp含有1个开放阅读框（open reading frame, ORF）和一个中止密码子，编码261个氨基酸。在5′端有75 bp的非编码区，在3′端含有288 bp的非编码区和Poly(A)27 bp。LhcaPe03编码的蛋白质等电点和分子量分别为5.08和27686.79 Da。该基因核酸序列含有3个2Fe-2S铁还原氧化蛋白的信号区和2个4Fe-4S铁还原氧化蛋白的信号区，推导的氨基酸序列中含有氨基化合物位点、蛋白激酶 C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N－肉豆蔻酰位点和叶绿素a/b结合蛋白位点，还有一个yiaA/B two helix domain。 (4)LhcaPe04基因部分cDNA为1071 bp的基因，含有完整的编码框，序列第1 bp开始到第738 bp含有1个开放阅读框和一个中止密码子，编码245个氨基酸。5′端未克隆出非编码区，在3′端含有304 bp的非编码区和Poly(A)29 bp。LhcaPe04编码的蛋白质等电点和分子量分别为6.95和26898.83 Da。该基因核酸序列含有2个2Fe-2S铁还原氧化蛋白的信号区，推导的氨基酸序列中含有蛋白激酶C磷酸化位点、N－肉豆蔻酰位点、N－糖基化位点和叶绿素a/b结合蛋白位点。 (5)通过 NCBI Blast软件分析得出与毛竹 Lhca基因同源性较高的物种是水稻和大麦。毛竹Lhca四条基因之间的核酸序列同源性高于推导的氨基酸序列的同源性。四条基因编码的四种蛋白分子二级结构组成，LhcaPe01与其它三条基因差别较大，而LhcaPe02、LhcaPe03和LhcaPe04三者之间差别不明显。根据SWISS MODEL预测和模拟，毛竹、大麦、水稻和玉米Lhca四条基因编码的蛋白模型较相似，毛竹PSI四种蛋白之间的差异较大。 (6)刚竹属三种竹种——红壳竹、毛竹和角竹保守区内核酸序列同源性非常高，Lhca1基因的同源性高达99％以上；Lhca2基因的同源性高达98％以上。总体而言，同属竹种的同源性高于毛竹与禾本科的水稻和大麦；三个竹种Lhca1基因的同源性又相对高于Lhca2基因，说明刚竹属内竹种的Lhca1基因比Lhca2基因更保守。 (7)PSΙ四条基因Lhca1～4在不同组织——新叶、老叶、茎尖、茎秆和笋中都有表达，但在不同组织中的表达水平存在差别。Lhca1基因在新叶中的表达量最高；Lhca2基因在老叶中的表达量最高；Lhca3基因和Lhca4基因在茎尖中的表达量最高。四条基因的表达量在不同组织中均以Lhca1基因最高；所有样品中以Lhca3基因在笋中表达量最低；四条基因在茎尖中的表达量均较高。 (8)不同光照处理的叶片，PSΙ四条基因表达量顺序均为Lhca1>Lhca4>Lhca2>lhca3，强光下表达下调，弱光下表达上调，上调和下调的幅度不同。光强为3000μmol·m-2·s-1时，四条基因表达都出现下调，表达量分别是正常的89.5％，30.6％，48.3％，63.9％；下调幅度顺序为Lhca2>Lhca3>Lhca4>Lhca1。光强为2000μmol·m-2·s-1时，表达量分别是正常的27.9％，17.8％，69.7％，35.1％；下调幅度顺序为Lhca2>Lhca1>Lhca4>Lhca3。光强为1600μmol·m-2·s-1时，表达量分别是正常的73.3％，51.8％，35.7％，85.4％；下调幅度顺序为Lhca3>Lhca2>Lhca1>Lhca4。 低光处理20天后叶片的相对表达量基本升高。光强为1000μmol·m-2·s-1时，四条基因表达都出现上调，表达量分别是正常的116.7％，115.4％，187.9％，102.4％；上调幅度顺序为Lhca3>Lhca1>Lhca2>Lhca4。光强为500μmol·m-2·s-1时，Lhca1、 Lhca3、和Lhca4基因表达上调，Lhca2基因基本不变；表达量分别是正常的237.4％，99.1％，122.2％，147.5％；上调幅度顺序为Lhca1>Lhca4>Lhca3>Lhca2。光强为10μmol·m-2·s-1时，表达量分别是正常的607.2％，168.5％，219.2％，149.6％；上调幅度顺序为 Lhca1>Lhca3>Lhca2>Lhca4。1600μmol·m-2·s-1光强表达量随时间的变化为：四条基因变化均呈一直下降趋势，先陡后缓。10和500μmol·m-2·s-1光强表达随时间延长，四条基因均先急速上升，然后缓慢下降，最终到达一个平衡点。 收起