摘要: 植物激素乙烯影响植物生长发育的多个过程，同时它也参与调控植物对环境中生物或非生物胁迫的响应。植物对体内乙烯水平的控制主要通过调节乙烯生物合成的关键酶—1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase,ACC synt... 展开 植物激素乙烯影响植物生长发育的多个过程，同时它也参与调控植物对环境中生物或非生物胁迫的响应。植物对体内乙烯水平的控制主要通过调节乙烯生物合成的关键酶—1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase,ACC synthase,ACS)的表达和活性来实现。ACS蛋白由多基因家族编码，它们的表达受到转录和转录后多个水平的调控。根据C-末端结构域的不同，ACS家族成员分为三类，其C-末端氨基酸序列的特点决定了它们翻译后调控的方式。在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，第一类ACS蛋白包含ACS1、2和6，第二类包含ACS4、5、8、9和11，第三类仅包含ACS7一个成员。拟南芥的三类ACS蛋白均是通过泛素/26S蛋白酶体途径降解，其中第一类和第二类ACS的C-末端作为E3泛素连接酶结合以及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)或钙依赖蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase，CDPK)磷酸化的靶位点，参与调控这两类ACS蛋白的稳定性;目前，对于第三类ACS蛋白中参与翻译后调控的具体区域或位点仍然不清楚。本课题以模式植物拟南芥的ACS7为代表，研究了第三类ACS蛋白翻译后调控的分子机制。 通过对不同物种来源的第三类ACS蛋白以及拟南芥ACS蛋白家族成员的氨基酸序列比对，我们发现第三类ACS蛋白的N-末端相比其他两类ACS的更长，因此推测N-末端可能在第三类ACS蛋白的翻译后调控过程中发挥一定的功能。为了验证这一推论，我们将拟南芥ACS7蛋白N-末端第1-54位氨基酸与报告基因β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase，GUS)进行融合，构建双元表达载体并获得相应的转基因拟南芥ACS7:N7(1-54)-GUS。对转基因幼苗中GUS融合基因表达水平的分析发现，ACS7 N-末端会显著地降低GUS融合蛋白的积累水平和稳定性;进一步分析表明N-末端的第1-14位氨基酸在参与负向调控GUS稳定性方面发挥着主要的作用。同时，我们分别构建了花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子和可诱导型启动子GVG系统驱动全长(ACS7FL)和缺失N-末端第1-14位氨基酸(ACS7Δ1-14)的ACS7蛋白表达的转基因拟南芥。在GVG:A CS7FL-Flag和GVG:ACS7Δ1-14-Flag转基因拟南芥中发现，两种形式的ACS7蛋白在催化活性上没有差异，但ACS7Δ1-14-Flag蛋白在光下相对于ACS7FL-Flag更为稳定。组成型或诱导过表达ACS7Δ1-14蛋白会促使转基因拟南芥产生更强烈的乙烯响应表型。利用26S蛋白酶体特异性抑制剂MG132处理可以有效地抑制GVG:ACS7FL-lag转基因拟南芥中ACS7FL-Flag蛋白的降解，但对GVG:ACS7Δ1-14-Flag转基因拟南芥中ACS7ΔH4-Flag蛋白的积累没有影响。这些结果表明N-末端参与介导了ACS7的降解，并且这种降解依赖于泛素/26S蛋白酶体途径。 我们还发现ACS7 N-末端所介导的蛋白降解受到体内发育和激素信号以及体外环境胁迫信号的调控。首先，N7(1-54)-GUS和ACS7FL-Flag蛋白在ACS7:N7(1-54)-GUS和GVG:ACS7FL-Flag转基因拟南芥黄化苗中的稳定性均高于在光下苗中。对ACS7:N7(1-4)-GUS转基因拟南芥分析还表明，在光照条件下N7(1-54)-GUS融合蛋白主要在种子萌发的后期和成苗的衰老叶片中积累水平较高，而在旺盛生长的幼苗和幼嫩的叶片中几乎没有积累。外源乙烯前体ACC处理、高温、失水和盐胁迫可以抑制N-末端所介导的蛋白降解，提高ACS7:N7(1-54)-GUS转基因幼苗中N7(1-54)-GUS融合蛋白的水平，黑暗处理则促进这一降解过程;另外，生长素可以特异地促进N7(1-54)-GUS融合蛋白在根部的积累。 此外，通过将ACS7 N-末端第1-14位氨基酸与实验室前期发现的一个叶片衰老的负调控因子 SSPP(SENESCENCE-SUPPRESSED PROTEINPHOSPHATASE)融合，获得35S:N7(1-14)-SSPP-HA转基因拟南芥。在植物旺盛生长期，我们发现35S:N7(1-14)-SSPP-HA转基因拟南芥由于过表达SSPP基因所引起的表型明显减弱，同时在发育后期部分地保留过表达SSPP造成的晚衰表型。这个结果暗示了ACS7 N-末端所介导的蛋白降解可能不具有ACS特异性，也可以介导其他植物蛋白的降解。 收起