摘要: 研究背景： 鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是鼻咽部上皮组织发生的恶性肿瘤，在世界各国均有发病，但以中国及东南亚其他各国发病率为最高。它是我国常见的恶性肿瘤之一，年发病率为10～25/10万，占全国恶性肿瘤死亡的2.81%。据WHO估算... 展开 研究背景： 鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是鼻咽部上皮组织发生的恶性肿瘤，在世界各国均有发病，但以中国及东南亚其他各国发病率为最高。它是我国常见的恶性肿瘤之一，年发病率为10～25/10万，占全国恶性肿瘤死亡的2.81%。据WHO估算，中国NPC发病占全世界80%以上，其中又以中国南方地区发病率为最高，如广东、广西、湖南等省，特别是广东的中部及西部的肇庆、佛山和广州地区：在肇庆的四会县，其发病率男性为25.12/10万，女性为12.11/10万；中山市男性为21.73/10万，女性为8.66/10万。全国范围内，鼻咽癌的发病率由南到北逐渐降低，如最北方的发病率不高于2～3/10万，但近年来我国北方地区的发病率也逐渐升高。 人类对于肿瘤发病机制的认识经历了一个漫长的过程，从早期的癌变二阶段学说演变到如今的多阶段学说，并形成了肿瘤分子谱的新概念。通过阐明遗传变异在癌变进程中的意义，可以为进一步确定肿瘤的分子靶标提供依据。 鼻咽癌的病因尚不明确，目前认为是环境因素和遗传因素共同作用的结果。环境因素中，咸鱼的食用与鼻咽癌的关联很强，吸烟与饮酒也是鼻咽癌可能的危险因素，然而其研究结论并不一致。但多项研究均显示，EB病毒感染是鼻咽癌的一个最重要的环境危险因素。人体感染EB病毒后会产生很多抗体来对抗EB病毒，在鼻咽癌病人的血清中可以测到高滴度的EBV抗体，鼻咽癌活检组织中有EBV核酸的存在，并且有潜伏膜蛋白1（LMP1蛋白）表达。LMP1基因是第一个被发现具有致癌潜能，能够转化细胞系，改变细胞表型的EBV潜在基因。它可以激活多条信号传导通路，包括NF-kB信号传导通路，PKA信号传导通路，JAK3/STATA信号传导通路以及ERK，P38和JNK通路，介导LMP1表达引发的各种下游病理效应，调节细胞增殖、凋亡、侵袭以及转移。 NF-kB是先天性免疫以及炎症反应的一个关键的调节元件，且在许多癌症中已经发现NF-kB的异常表达。NF-kB可以被多种刺激信号诱导激活，其有大量的靶基因，包括编码抗生物肽、细胞因子、趋化因子、应激反应蛋白、以及抗凋亡蛋白等的基因。NF-kB活性对于淋巴细胞的存活、活化以及发动正常的免疫反应非常重要。由LMP1激活的NF-kB可以诱导在LPM1介导的肿瘤形成中发挥关键作用的相关基因的表达。因此NF-kB信号通路可能通过调节炎症反应和或与LMP1相互作用，影响鼻咽癌的发生和发展。NF-kB信号系统包括两个蛋白家族，即 NF-κBs家族和IκBs家族，该信号系统通过NF-κB二聚体与IκB的结合和分离介导信号传导，调节细胞的许多病理生理过程，包括免疫应答、炎症，细胞增殖、细胞凋亡以及细胞钙稳态等。最常见的NF-κB二聚体由p50和p65组成，该二聚体通过与IκBa结合和分离，调节其功能，其中p50由NFKB1基因编码，IκBa由NFΚBIA基因编码。 基因单核苷酸多态(SNP)可通过影响转录因子的结合能力而影响基因的表达，从而与肿瘤发病相关。基于Genbank单核苷多态性数据库()的生物信息学分析发现，NFKB1基因启动子区仅存在一个常见多态位点(最小等位基因频率>5%)，即-94ins/delATTG(rs28362491)，2758G>A(rs696)和-826C>T(rs2233406)分别为NFΚBIA基因3’UTR区和启动子区的常见多态位点为，进一步的功能分析()显示以上位点皆是潜在的功能性位点。因此，本课题拟采用病例-对照研究方法，通过检测NFKB1基因-94ins/delATTG多态及NFΚBIA基因2758G>A、-826C>T多态在NPC病例和对照组中的基因型，分析NFKB1及NFΚBIA多态与人群NPC发病的关联，并通过体外构建报告基因质粒，进一步对关联分析结果进行功能验证，阐述NFKB1和NFΚBIA多态与我国南方人群NPC发病的关联的分子生物学实质。 研究目的： 研究NFKB1基因-94ins/delATTG多态和NFΚBIA基因2758G>A、-826C>T多态与我国南方人群NPC发病的关联，并分析基因与环境暴露因素在NPC发病中的交互作用，最后通过关联位点的生物学功能实验阐述基因遗传变异与NPC发病关联的分子生物学实质，为NPC的防治提供科学依据。 研究方法： 运用病例-对照研究的方法，于2007年8月～2011年11月连续收集广州市区及周边共四所医院新诊断的经组织病理学检查证实的原发性NPC病例906例，按性别相同、年龄±5岁频率配比原则于同期参加社区健康体检的10000名体检者中随机选取906例健康人作为对照。 采用Taqman基因分型技术检测NFKB1基因-94ins/delATTG(rs28362491)多态位点和NFΚBIA基因2758G>A(rs696)、-826C>T(rs2233406)多态位点的基因型，预先针对不同等位基因设计的两条探针于5’端分别标记FAM基团(蓝色)和VIC基团(红色)，3’端标记淬灭萤光MGB基团，在ABI7500系统基因分型模块上，根据不同颜色萤光值判别基因型；为验证基因型判断的准确性，从NPC病例和健康对照中分别随机选取30个样本进行PCR扩增，扩增产物进行测序验证。 采用SAS9.13软件进行χ2检验以分析性别、年龄、吸烟、饮酒、家族肿瘤史、各多态位点不同等位基因及基因型在病例组和对照组间频率分布的差异。进行Hardy—Weinberg平衡检验，比较对照组实际基因型频率与预期基因型频率的吻合程度，判断对照组人群选择的代表性。采用多因素非条件Logistic回归，分析NFKB1基因-94ins/delATTG多态、NFΚBIA基因2758G>A和-826C>T多态与人群NPC的危险性关联，同时分析变异等位基因与NPC发病风险的剂量-效应关系；所有检验均为双侧检验，检验水准为α=0.05，P<0.05为有统计学差异。 采用体外质粒构建与报告基因检测技术分析关联结果的功能机制：选择2758G>A位点为GG基因型的DNA样本，PCR扩增296bp的NFΚBIA基因的3’UTR区（相对于翻译终止子下游+1bp到+296bp的序列），将PCR产物连接到psiCHECK-2 basic载体上，酶切、测序鉴定。之后应用定点突变技术，将2758G等位基因突变为2758A等位基因，即构建含不同2758G>A等位基因的萤光素酶报告基因质粒。生物信息学分析发现NFΚBIA基因2758G>A变异会影响miR-449a和miR-34b结合到mRNA的能力，因此，将上述报告基因质粒单独或与microRNA模拟物或microRNA抑制剂共转染鼻咽癌细胞系CNE-1和CNE-2，在生物发光检测仪上检测不同质粒的萤光素酶活性水平。采用t检验分析体外萤光素酶报告基因实验的结果。 研究结果： 1.1人口学基本特征 共收集NPC病例906例，并配比收集对照906例。其中，NPC病例按临床分期有I期40例，II期244例，III期338例，IV期284例；EBV感染者723例，未感染者183例；单因素分析发现，性别、年龄在病例与对照组的分布无显著差异(P性别=1.000，P年龄=0.661)，吸烟在病例与对照间分布差异具有统计学意义(P吸烟=0.021)，饮酒、癌症家族史在病例组和对照组的分布无统计学差异(P饮酒=0.531，P癌症家族史=0.123)。 1.2 NFΚB1与NFΚBIA基因多态与NPC发病风险的关联分析 所研究三个多态位点各基因型在对照人群中的频率均符合Hardy-Weinberg平衡(NFKB1-94ins/delATTG:c2=1.126,P=0.289;NFΚBIA2758G>A:c2=1.486,P=0.223; NFΚBIA-826C>T:c2=0.702,P=0.402)。NFΚBIA2758G>A多态基因型在病例与对照组间频率分布差异具有显著统计学意义（P<0.01）。 分析发现，NFKB1-94ins/delATTG基因型del/delATTG、ins/delATTG、ins/insATTG在病例和对照组中的频率分别为18.76%、51.55%、29.69%和21.30%、47.79%、30.91%，差异无统计学意义（P=0.227）。 NFΚBIA启动子区-826C>T基因型CC、TC、TT在病例组和对照组中的频率分别为77.92%、20.42%、1.66%和76.60%、22.19%、1.21%，差异亦无显著的统计学意义(P=0.501)。 对于NFΚBIA3’UTR区2758G>A多态，以GG基因型个体为参照，AA基因型携带者发生NPC的危险显著上升(adjustedOR=1.32;95%CI=1.01-1.72)；在隐形模型AA vs（GG+AG）中，AA基因型携带者患NPC的危险是携带G等位基因者的1.39倍(adjustedOR=1.39;95%CI=1.11–1.74)。进一步通过NFΚBIA基因-826C>T和2758G>A两个多态位点的单体型分析，发现其在病例组与对照组中的分布差异具有显著的统计学意义（P<0.005），与T-G单体型相比，携带C-A和T-A单体型的个体发生鼻咽癌的风险显著增加（C-A:adjustedOR=1.32,95%CI=1.04-1.67; T-A:adjustedOR=3.21;95%CI=1.93-5.33）。分层分析发现2758AA变异纯合子对鼻咽癌的危险效应在EBV感染者中更(adjustedOR=1.55,95%CI=1.23-1.95)显著，而其他环境暴露因素各亚层中NFΚBIA2758G>A多态位点各基因型在病例与对照组中的频率分布无显著差异；非条件logistic回归分析未发现基因与环境因素之间存在交互作用。 1.3 NFΚBIA3’UTR区2758G>A转录活性检测 关联分析发现NFΚBIA2758G>A多态位点与NPC发病风险相关，为从功能上解释这个关联结果，我们通过体外克隆技术结合定点诱变，分别成功构建含2758G等位基因和2758A等位基因的萤光素酶报告基因质粒(p2758G和p2758A)，并转染人鼻咽癌细胞系CNE-1和CNE-2。结果显示两个细胞系内p2758A质粒的Luciferase活性水平都显著低于p2758G质粒的Luciferase活性水平(P值分别为0.008，0.011)。 生物信息学分析发现NFΚBIA基因2758G>A变异会影响miR-449a和miR-34b结合mRNA的能力，因此进一步将报告基因质粒与microRNA模拟物或者抑制剂共转染细胞系CNE-1和CNE-2，进行萤光素酶活性检测。结果发现，在两个细胞系中，miR-449a模拟物能降低报告基因质粒p2758A的相对萤光值（P=0.002 for CNE-1 and P=0.032 for CNE-2），相反miR-449a抑制剂能显著上调报告基因质粒p2758A的相对萤光值（P<0.001 for CNE-1 and P=0.039 for CNE-2），但是质粒与miR-34b模拟物共转染实验并未发现miR-34b模拟物对两种报告基因质粒的萤光素酶活性水平有任何显著的影响。 创新之处： 本课题首次发现了NFΚBIA基因3’UTR区2758G>A位点多态与我国南方人群鼻咽癌发病有关，并通过功能实验验证了这一关联结果。 收起