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国家工程技术图书馆
2022年11月29日
摘要: 在本文第一部分的工作中,我们对转录辅助因子JMY在大脑皮层发育过程中的表达和作用进行了详细研究。哺乳动物神经系统的发育可受到多种分子或因素的调节,这些调节机制对神经系统的结构功能的形成演化以及发育相关性的神经系统疾病的发病机制都具有重... 展开 在本文第一部分的工作中,我们对转录辅助因子JMY在大脑皮层发育过程中的表达和作用进行了详细研究。哺乳动物神经系统的发育可受到多种分子或因素的调节,这些调节机制对神经系统的结构功能的形成演化以及发育相关性的神经系统疾病的发病机制都具有重要的意义。JMY(Junction-mediating andregulatory protein)是一种转录辅助因子,在炎症和免疫反应中起重要的调控作用,但在神经系统的表达情况和相关功能迄今还未被报道,仍不清楚。新近的临床研究发现,JMY基因的突变与大脑发育异常和脊髓病变等有关,提示了JMY在神经系统中的潜在作用。因此,我们结合发育生物学、分子生物学、组织细胞学和遗传学的方法,综合探讨了JMY在小鼠大脑皮层及神经元发育过程中的表达规律和相应的生理作用。实验结果表明,Jmy基因在神经系统中可丰富表达,在胚胎后期和生后早期的脑内有高水平表达,以E16-E18阶段为顶峰,提示了JMY在大脑发育的过程中可能起着特定的作用。随后,我们联合胚胎电转和RNAi的方法降低脑内神经元中JMY的表达水平,结果发现皮层神经元的迁移受到影响;且与RNAi敲减效率相关,存在基因剂量-效应关系。该表型可以被过表达野生型的JMY所逆转。为了进一步确认这点,我们设计并制备了Jmy-floxed小鼠,然后依次将Nestin启动子或DCX启动子驱动的Cre质粒与Loxp-Stop-Loxp-eGFP质粒共转入Jmy-floxed小鼠脑内的细胞中,分别进行了观察,取得了与前述相一致的结果。这些结果提示JMY能调节皮层神经元的迁移。进一步地,我们分别使用野生型小鼠进行RNAi电转和直接使用Jmy-/-,Nestin-Cre小鼠进行观察,还发现JMY可以影响小鼠发育期脑内神经前体细胞的分裂增殖。此外,体外培养细胞的实验表明,JMY对神经元的轴突和树突发育均产生了影响,说明JMY对神经元突起的发育是必需的。这项研究工作初步阐明了JMY在大脑发育过程中的功能,相关的研究发现揭示了皮层神经元的发育调控新机制,并为今后进一步了解JMY在脑内的作用和相关脑疾病的发病机制打下了良好基础。 在本文第二部分的工作中,我们对阵发性运动诱发性运动失调综合征(Paraxysmal kinesigenic dyskinesia,PKD)相关基因PRRT2在脑内的表达、作用及其机制进行了深入研究。PKD是一种严重的中枢神经系统疾病,主要表现为非自愿性运动所诱发的肌张力障碍、舞蹈病、手足徐动症、颤搐或这些运动失调症状的组合。目前该病的发病机制仍不清楚。最近研究表明编码脯氨酸跨膜蛋白PRRT2的基因突变与PKD相关,为该病首次带来分子机制上的可能解释。但是,作为第一个被分离鉴定出来的PKD相关基因,PRRT2在体内的生物学功能是什么?如何在调控运动功能?迄今未知。本部分工作从这些科学问题出发,综合使用组织形态、基因操作、电生理、动物模型和药理学等方面的研究手段,探讨PRRT2在脑内的表达、功能及相应的机制。研究结果显示,PRRT2在神经系统内选择性地高表达,以小脑外分子层、海马苔藓纤维和黑质表达最为显著。通过制备特异性的抗体,使用免疫组织化学、荧光标记、包埋后免疫金标记、包埋前辣根过氧化物酶标记和免疫印迹等多种方法,我们发现,PRRT2选择性地在脑内高表达,在神经元内的表达以轴突和突触前结构为主,在囊泡膜和突触前膜上有丰富表达,提示了PRRT2可能在脑内突触传递过程中发挥着重要的作用。我们随后成功模拟病人的突变情况,制备了PRRT2突变小鼠。对突变小鼠进行检测的结果表明,PRRT2截短突变后,蛋白不能表达或降解,在脑内消失,说明了PKD病人的发病是由于Prrt2基因的功能缺失所致。接着,当我们先后使用Kindling、 PTZ和高温模型成功诱导杂合子和纯合子Prrt2突变小鼠出现运动失调和肌张力障碍等症状,首次在动物模型上良好地复制了PKD发病现象,并且这些症状的严重程度同蛋白表达量负相关。进一步地,对突变小鼠和其同窝对照小脑内超微结构的观察表明,PRRT2可以调控突触囊泡到突触前膜上的定位情况,说明PRRT2在运动环路上的突触传递中可能起到重要的调节作用。最后,针对特定的细胞环路采用全细胞电生理记录的方法,我们发现PRRT2突变或消失会造成脑内短时程可塑性的异常,PRRT2可以调节突触传递功能,从而在相关脑区运动功能的调控中发挥着特定的作用。我们的研究工作详细而系统地揭示了PRRT2在脑内的表达情况,解析了相关的一些重要生物学功能,为大家了解PRRT2在体内的生理作用提供了形态学和功能学的详实数据和充分依据,推进了人们对PKD发病机制的认识和理解,也为有关PKD的进一步深入研究提供了可靠的动物模型。 收起
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