摘要: 拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)是我国重要的海水养殖蟹类,具有较高的营养价值、药用价值和经济价值,但在人工养殖过程中容易受水质、细菌和病毒的感染等而导致养殖过程中存活率低,从而给拟穴青蟹的养殖产业造成巨大的损失。虽然已经有不少的应对策略如... 展开 拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)是我国重要的海水养殖蟹类,具有较高的营养价值、药用价值和经济价值,但在人工养殖过程中容易受水质、细菌和病毒的感染等而导致养殖过程中存活率低,从而给拟穴青蟹的养殖产业造成巨大的损失。虽然已经有不少的应对策略如免疫增强剂等,但如何通过提高拟穴青蟹自身的免疫力来抵抗日益严重的病害已成为目前蟹类养殖业中一个亟待解决的问题。关于拟穴青蟹免疫相关基因的研究近年来也逐渐增多,在研究过程中对基因表达谱的分析是探究基因功能的重要方法之一,主要通过荧光定量 PCR(real-time quantitative PCR,Real-time qPCR)技术利用PCR体系中添加的特定荧光基团,对目的基因产物的变化进行实时检测。为了获得真实可靠的实验结果,在此过程中通常引入内参基因以消除不同样品在样本量、样本质量以及反转录效率,进行数据校正和标准化。 本论文拟从分子生物学的角度,借助荧光定量PCR技术和GeXP多重PCR技术,对拟穴青蟹不同组织中及细菌感染条件下部分免疫相关基因及内参基因的表达变化规律进行了表达模式分析,探讨了免疫相关基因在青蟹免疫过程中的作用,并对不同内参基因在各组织中及细菌感染条件下的表达稳定性进行了分析,为拟穴青蟹免疫相关基因的研究提供必要的理论基础。主要研究结果总结如下: 1.拟穴青蟹巨噬细胞移动抑制因子的克隆和表达谱分析 巨噬细胞移动抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF)是一种发现较晚的功能多样化的细胞因子。运用克隆测序从拟穴青蟹的肝胰腺cDNA文库中分离得到了一条cDNA序列,通过Mega软件比对发现,这条cDNA序列与其他物种巨噬细胞移动抑制因子基因之间具有较高的同源性,经综合分析确定为巨噬细胞移动抑制因子基因(SpMIF)。拟穴青蟹MIF cDNA由734 bp的碱基组成,包含一个363 bp的开放阅读框,编码一个分子量约为13.46 kDa、等电点约为6.82的由120个氨基酸残基组成的蛋白质。该基因编码的巨噬细胞移动抑制因子蛋白与中华绒螯蟹的该蛋白序列有68%的相似度。运用 Quantitative real-time PCR技术研究了MIF基因在拟穴青蟹肝胰腺、血液、心脏、肌肉、精巢和鳃6个组织中的表达差异,使用18S rRNA作为内参引物,检测结果显示在6个组织中该基因均有表达,其中在肝胰腺和血液中的表达量最高。用副溶血性弧菌注射成体拟穴青蟹,结果发现,SpMIF表达量明显提升,在8h后达到最高值,随后缓缓下降,到48 h恢复正常水平。可见,经弧菌刺激后MIF在血液中有较快的释放。本实验证明巨噬细胞移动抑制因子可能在拟穴青蟹的免疫和抗菌过程中具有重要作用,为深入研究该基因的结构和功能奠定基础。 2.拟穴青蟹C型凝集素受体的克隆和表达谱分析 C型凝集素受体是C型凝集素家族的一员,参与生物体内的多项生理过程。本研究在拟穴青蟹cDNA文库获得一条C型凝集素受体的cDNA全长序列,命名为SpCLR。SpCLR全长为697 bp,包含poly(A)结尾,开放阅读框长度为510 bp,编码一个含有169个氨基酸残基的蛋白质。预测该蛋白分子的量为19.236 kDa,等电点为4.57。使用荧光定量PCR技术检测发现SpCLR在所检测的肝胰腺、血液、心脏、精巢、鳃和肌肉六个组织中均有表达,肝胰腺中表达量最高,检测时使用elongationfactor1α和18SrRNA作为内参基因。使用副溶血性弧菌对成体处理后,发现血液中SpCLR的表达量从8 h检测到上升,到12 h检测到最高值,检测时使用elongationfactor1α、18SrRNA和ubiguitin作为内参基因。说明SpCLR在肝胰腺中发挥重要作用,并能对弧菌刺激进行免疫应答。C型凝集素参与大量的先天免疫防御和细胞连接反应,本研究对了解拟穴青蟹的免疫系统具有重要的参考价值。 3.拟穴青蟹免疫相关基因表达定量PCR分析中内参基因的适用性分析 以拟穴青蟹6个不同组织(肝胰腺、血液、心脏、肌肉、精巢和鳃)及副溶血性弧菌(Vibio Parahaemolyticus)刺激后不同时间点(0、4、8、12、24、48和72 h)的血液样本为研究对象,应用GeXP技术检测探讨β-actin、16SrRNA、18SrRNA、28SrRNA、α-Itubulin、GAPDH、ribosomalproteinL13、elongation factor1α、elongationfactor2、arininekinase和ubiguitin共11种不同内参基因mRNA水平的表达情况。使用geNorm和NormFinder软件进行数据分析,结果显示,在6个不同的组织中,18SrRNA、elongationfactor1α、β-actin、ubiguitin、GAPDH和α-Itubulin六种内参基因稳定性较高,可以作为内参基因使用,其中以elongationfactor1α和18SrRNA表达稳定性最好,推荐共同作为内参基因使用;经副溶血性弧菌刺激后的血液样本中的实验结果显示elongationfactor1α、ubiguitin、18SrRNA表达稳定性最高,推荐以此三个基因共同作为内参,对相对定量数据进行校正。本研究对拟穴青蟹功能基因的定量分析研究提供了参考依据。 综上所述,本研究克隆得到了两个与拟穴青蟹免疫相关基因的cDNA序列,运用Quantitative real-time PCR技术研究了它们在拟穴青蟹不同组织以及经过免疫刺激后不同时间的差异表达模式;对拟穴青蟹11个候选内参基因在不同实验设置下的适用性进行了分析,为今后拟穴青蟹的基因表达谱分析的准确性与可靠性提供了参考依据。 收起