摘要: 拟穴青蟹(Scylla paramamosain),隶属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、、短尾亚目(Brachyura)、梭子蟹科(Portunidae),是我国沿海重要的海洋经济蟹类,具有重要的商品价值。近些年,随着拟穴青蟹的养殖规模不断扩大,很... 展开 拟穴青蟹(Scylla paramamosain),隶属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、、短尾亚目(Brachyura)、梭子蟹科(Portunidae),是我国沿海重要的海洋经济蟹类,具有重要的商品价值。近些年,随着拟穴青蟹的养殖规模不断扩大,很多国内外研究学者对于如何获得生长快速、经济性状好的优良拟穴青蟹品种而进行了大量研究。本实验室正在开展拟穴青蟹转录组高通量测序工作,在测序过程中发现了两个参与生长发育调控的生长候选基因:β-Actin基因和TGF-βR基因。本研究克隆了这两个基因,并研究了其表达调控及作用机理,为进一步开展拟穴青蟹生长发育相关基因分子调控机理的研究提供基础资料。 1.β-Actin具有高度保守性、表达的持续稳定性以及转录的大量、高效性特点,这些特点使得β-Actin基因常作为内标基因使用,并利用β-Actin的氨基酸序列构建分子进化树,分析物种间的进化关系。然而近年来研究发现,β-Actin基因有时也会受到不同生理状态或者环境的调控而出现表达水平的差异。因此,在采用β-Actin基因作为分子内标开展实验研究时,必须首先评价其在该物种中的表达特征。本研究针对β-Actin基因能否作为内参基因进行了实验评估,并分析了拟穴青蟹与其他物种间的进化关系。 研究采用RT-PCR和RACE技术,从拟穴青蟹肌肉组织中鉴定出β-actin基因的cDNA全序列。序列分析结果表明:拟穴青蟹β-actin基因全长1434 bp,包括完整的开放阅读框1131 bp、5’端非翻译区60 bp及3’端非翻译区243 bp。该基因编码376个氨基酸,蛋白分子量为41.79 KDa,等电点为5.205。同源性比较表明,该基因与其它物种具有高度的氨基酸保守性。聚类分析表明,拟穴青蟹与百慕大陆蟹的亲缘关系最近。荧光定量PCR分析表明,β-Actin基因在拟穴青蟹血液、心脏、肝胰腺、胃、鳃、肌肉、精巢、结缔组织中均有表达,在肌肉组织中的表达量最高,在胃、精巢、血液、肝胰腺、心脏、鳃组织中的表达量依次降低,在结缔组织中的表达量最低;β-Actin基因在仔蟹3期、蜕壳前期、脱壳后期三个时期的均具表达,但是表达量逐渐增加,具有明显的差异性;由于该基因在拟穴青蟹不同组织、不同时期的表达量存在明显的差异,因此不适用于作为内参基因使用。 2. TGF-βR基因是启动TGF-β超家族成员发挥信号转导作用的重要受体因子。在信号转导过程中需要I型和 II型两类受体基因的参与,这些受体均为具有激酶活性的跨膜受体,胞内区和胞外区默契配合共同发挥作用。TGF-β超家族成员首先与细胞膜表面的II型和 I型受体结合,启动其信号传导,进而激活下游 S mad蛋白,将信号传递至细胞核内,调节靶基因的转录。本研究采用克隆技术对拟穴青蟹中 TGF-β/Smad信号通路中TGF-βR基因进行了cDNA和 DNA克隆,并运用生物信息学方法分析了该基因核苷酸和氨基酸序列特征;利用实时荧光定量PCR技术对TGF-β受体基因进行了组织表达分析,为拟穴青蟹中TGF-β/Smad信号传导和相关基因功能的研究,及生长性状相关标记的开发和应用提供了参考。主要结果如下: 在拟穴青蟹中,首次克隆得到了TGF-βR基因的cDNA全长序列为2035 bp,包括完整开放阅读框1164 bp,5’端非翻译区607 bp,3’端非翻译区264 bp。3’ UTR包含有16 bp的poly(A)尾,在poly(A)上游27 bp处可见保守的加尾信号序列AAATAA。预测该基因的二级结构,发现该基因具有膜外区、胞内区以及跨膜区等TGF-β超家族丝氨酸/苏氨酸激酶受体特有的结构特征,且该基因具有明显22个氨基酸残基组成的信号肽序列。序列比对分析显示:该基因在GS区域高度保守,且与其他物种的I型受体同源性较高。根据TGF-βR基因的氨基酸构建的系统进化树,明显的分为三支,该基因聚类与I型受体。检测该基因在拟穴青蟹8个组织的表达水平,该基因在所有组织中具有表达,在性腺和肌肉组织中的表达量最高,推测该基因参与青蟹肌肉的生长调节和生殖发育过程。 根据特异引物扩增得到TGF-β R基因的一个内含子序列,长度为302 bp,剪切位点符合GT-AG规律。在拟穴青蟹野生群体和家系中扩增该内含子序列并比对,发现该序列比对结果完全一致,没有发现多态性位点。这为进一步研究拟穴青蟹TGF-β/Smad信号传导和相关基因功能的研究,及生长性状相关标记的开发和应用提供了参考。 收起