摘要: 目的:间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类分布广泛且具有多向分化潜能的成体干细胞，能迁移到炎症和损伤组织部位。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H.pylori)是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的重要病因，与胃癌的发生密切相关，H.pylori... 展开 目的:间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类分布广泛且具有多向分化潜能的成体干细胞，能迁移到炎症和损伤组织部位。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H.pylori)是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的重要病因，与胃癌的发生密切相关，H.pylori感染的胃肠道上皮细胞能促进MSCs向胃肠粘膜层募集。因此，MSCs是H.pylori感染所致胃炎微环境中的一种重要成份，然而在H.pylori导致的胃上皮细胞损伤或恶性转化中MSCs究竟起何作用及其机制迄今仍不清楚。 因此，本研究旨在探讨H.pylori对MSCs的影响及其对胃上皮细胞的作用及机制，试图阐明MSCs参与H.pylori对胃损伤或胃癌发生、转移及治疗中的作用及机制，为胃癌发生与诊疗提供新的依据。 方法:体外模拟体内H.pylori(11637)感染过程，采用H.pylori(11637)活菌作为处理因素，与人脐带来源的间质干细胞(human umbilical cord MSCs，hucMSCs)）以感染指数100∶1共培养24h，观察细胞形态变化，收集对照组及实验组的细胞用于后面的实时定量PCR及蛋白免疫印迹检测相关基因，并收集共培养的上清3000转每分钟，离心5min，将上清置-80℃贮存备用。所有实验均在同等条件下重复3次。分别用实时定量RT-PCR、Westernblot方法检测H.pylori作用前后MSCs中癌相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts，CAFs)相关标志分子(FAP、N-cadherin、Vimentin、α-SMA等)表达变化情况。采用Luminex及ELISA法检测H.pylori作用hucMSCs后相关细胞因子的分泌情况。用Western blot法检测H.pylori刺激培养后的hucMSC中NF-κB水平、NF-κB核转位、磷酸化NF-κB及NF-κB抑制蛋白IκB-α的表达变化。应用NF-κB特异性抑制剂PDTC预处理MSCs90min，再用H.pylori刺激培养hucMSCs，观察其是否能干预H.pylori对MSCs的刺激效应。采用MSCs培养上清及H.pylori与MSCs共培养的上清分别与正常胃上皮细胞(GES-1细胞)株共培养48h，观察培养后的细胞形态变化，收集细胞并分别用实时定量RT-PCR和蛋白免疫印迹检测共培养后胃上皮细胞/胃癌细胞中EMT相关标志分子如E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等的表达情况。采用Transwell法检测不同上清处理后的GES-1细胞其迁移能力的变化。用手工计数法和MTT法检测正常胃上皮细胞GES-1在不同条件培养基处理后的生长曲线变化。应用平板克隆形成实验检测三种培养基处理过的GES-1细胞的克隆形成能力。流式细胞术和蛋白免疫印迹法分别检测细胞凋亡与凋亡相关蛋白表达，同时检测三种培养基处理过的GES-1细胞癌基因、抑癌基因及干性相关基因(Sox2、Nanog及BMI)的变化。应用NF-κB特异性抑制剂PDTC(10μM)预处理MSCs90min，再用 H.pylori刺激培养hucMSCs，取其上清与GES-1细胞共培养48h作为实验组，同时设立正常培养基和H.pylori刺激培养hucMSCs的上清再培养GES-1两组，以观察NF-κB参与MSCs转化的同时，是否还参与转化的间质干细胞对胃上皮细胞的损伤作用。所有数据均采用均数±SD方式表示，用SPSS统计软件对数据作进一步分析，多组间比较可用单因素方差分析法分析，对照组与实验组间两两比较用Student't-t检测，如数据不满足方差齐，则采用Tamhane'T2方法进行结果校正。 结果: H.pylori刺激后的MSCs细胞形态更倾向于细长，胞质出现明显的空泡变性，有CAFs样成纤维细胞变化的倾向。实时定量RT-PCR和Western blot结果显示H.pylori作用24h后的MSCs中CAFs相关标志分子Vimentin、N-cadherin、α-SMA及FAP等均有不同程度的升高(P＜0.05)。Luminex及ELISA法检测H.pylori作用后的hucMSCs分泌大量细胞因子。H.pylori刺激的MSCs胞核中NF-κB含量升高，而胞质中则下降，磷酸化的NF-κB在刺激组也是升高，存在时间依赖性，而NF-κB抑制蛋白IκB-α的表达下降。NF-κB特异性抑制剂PDTC抑制了H.pylori刺激的MSCs向CAFs样成纤维细胞的转化，同时还抑制了H.pylori刺激MSCs时分泌增加的一些因子的表达。H.pylori刺激培养的hucMSCs上清作用于GES-1细胞48h后，光学显微镜下观察到GES-1细胞形态较正常对照组变的细长如梭形，成纤维状或纺锤形，细胞两端尖细，细胞排列紊乱，部分细胞具有典型的间质干细胞的表型，与EMT相关的间质标志物N型钙粘蛋白(N-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)等基因表达明显上调，而上皮标物E-钙粘蛋白(E-cadherin)基因表达明显下降，这几种分子的蛋白表达变化情况与mRNA变化趋势一致。另外，结果还显示体外经H.pylori处理后的MSCs可以促使正常胃上皮细胞发生EMT，其迁移能力、克隆形成能力及相关干性指标(Sox2、Nanog和BMI)的表达均增强，凋亡相关基因的蛋白表达及原癌基因与抑癌基因之间的平衡也部分被打破。被H.pylori感染后转化的间质干细胞在促进胃上皮细胞发生EMT的同时，还使其获得了部分在肿瘤细胞才能表现出来或典型表现的生物学特征或表型。采用H.pylori刺激PDTC预处理的hucMSCs上清并不能促使胃上皮细胞发生典型的EMT现象。 结论: H.pylori能促使MSCs向癌相关成纤维细胞样细胞转化，并伴有相应细胞因子的分泌。H.pylori对胃上皮细胞损伤或恶性转化的方式之一，是通过诱使MSCs向CAFs样转化，再由CAFs样转化的成纤维细胞进一步发挥对胃上皮细胞的作用来实现的。H.pylori作用后的MSCs促进胃上皮细胞/胃癌细胞发生EMT，在肿瘤发生和进一步的恶性转化过程中起重要作用，这一作用机制与NF-κB信号通路活化有关。 本研究初步探讨了MSCs参与H.pylori慢性感染所致胃癌发生的作用及机制，对胃癌发生、转移及新的治疗靶点的寻找具有重要的意义。 收起