摘要: 植物microRNA(miRNA)是广泛分布于植物基因组中的一类长度约19-24个核苷酸的内源非编码的单链小分子RNA，是植物基因表达的重要调节因子。它主要通过介导靶基因(靶)的裂解或抑制靶的翻译从转录后水平调控靶的表达，在植物的生长、发育、分化、凋亡、新... 展开 植物microRNA(miRNA)是广泛分布于植物基因组中的一类长度约19-24个核苷酸的内源非编码的单链小分子RNA，是植物基因表达的重要调节因子。它主要通过介导靶基因(靶)的裂解或抑制靶的翻译从转录后水平调控靶的表达，在植物的生长、发育、分化、凋亡、新陈代谢、应激反应等方面起着重要的调控作用。植物miRNA是植物功能基因组学研究的主要内容之一。葡萄(Vitis viniferaL.)是世界性重要水果，也是我国最重要经济果树之一。目前，尽管已有一些葡萄miRNA识别、鉴定的报道，但所有这些鉴定的葡萄miRNA均来自欧亚种的酿酒葡萄，而且这些欧亚种的不同品种中约30％同源miRNA存在序列差异。因此，在不同葡萄品种群与葡萄种上开展葡萄miRNA及其靶基因的识别、鉴定及作用方式研究对于更全面认识葡萄miRNA的特性，功能及葡萄种间的进化具有重要意义，也为葡萄功能基因组学的全面开展奠定了重要研究基础。 本研究以欧美杂种(hybrid of V.vinifera and V.labrusca)的鲜食葡萄‘夏黑’(Summer x Black)和野生的山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)为试验材料，利用生物信息学预测、miR-RACE、Solexa测序、Degradome测序、qRT-PCR.PPM-RACE和RLM-RACE技术以及等技术系统地开展了葡萄miRNA(Vv-miRNA)及其靶基因的鉴定与特征性分析，并研究了miRNA调控靶基因的主要作用方式以及作用方式的时空性。主要研究结果如下: 1.利用miR-RACE技术在欧美杂种的鲜食葡萄品种‘夏黑’上验证了156条生物信息学预测的miRNAs的精确序列，并通过生物信息学方法预测了134条miRNAs的靶基因。进一步对随机选择的10对Vv-miRNAs及其靶基因在葡萄叶、茎、卷须、花序、花和果实六种不同组织中进行荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)表达分析，结果表明不同Vv-miRNAs及其靶基因在葡萄不同组织具有不同的表达水平，且二者的表达水平之间存在一定的负相关。同源miRNA的靶模式比较分析发现不同葡萄品种的同源Vv-miRNAs的碱基变异一般不改变其靶基因，葡萄与拟南芥中同源miRNA序列的碱基变异易改变它们的靶模式。 2.构建了‘夏黑’葡萄不同发育时期的花序、花、果实小RNA(sRNA)文库，通过Solexa测序以及miRNA序列的保守性和二级结构的典型性分析，共鉴定了130条保守的Vv-miRNAs和80条潜在的非保守的Vv-miRNAs(包含72条新的Vv-miRNAs和8条已知的非保守的Vv-miRNAs)。在80条非保守Vv-miRNAs中，有42条(52.5％)在葡萄不同组织中表达，其中20条仅有葡萄果实中表达的特异性。利用生物信息学方法预测了56新的Vv-miRNAs的130条靶基因。同源基因的功能注解表明，这些靶基因在葡萄花果发育以及对环境胁迫反应的应答过程中可能起着重要作用。 3.为了进一步认识Vv-miRNA调控靶基因的作用方式，利用5'-RLM-RACE(RNA ligase-mediated5'apid amplification of cDNA ends)和3'-PPM-RACE(Poly(A)polymerase-mediated3'rapid amplification of cDNA ends)技术对21条Vv-miRNA的36条潜在的靶基因及作用方式开展鉴定。结果验证了18条Vv-miRNAs的31条靶基因并鉴定了它们之间的裂解作用方式及裂解位点，其中约94.4％的Vv-miRNA介导靶基因的裂解位点在miRNA的5'端第10位碱基。Vv-miRNAs及其靶基因在葡萄8种组织的表达水平之间存在相反的变化趋势，靶基因裂解产物在这些组织的积累模式与相应的Vv-miRNAs的表达模式基本一致。 4.为了认识原产中国的重要野生葡萄种山葡萄miRNA的功能特性，并进一步研究不同葡萄种同源miRNA的差异，对山葡萄中的小RNA开展了挖掘。通过Solexa测序共鉴定出126条保守miRNAs和34条非保守miRNAs，发现了72条新的山葡萄特异miRNAs(Va-miRNAs)。利用miR-RACE技术验证了40条新的Va-miRNAs的精确序列。通过qRT-PCR检测到随机选择的18条Va-miRNAs在山葡萄7个不同组织的表达。Va-miRNAs在28种植物(包括不同葡萄种群)间具有较高的保守性，但同源miRNAs也存在一定的碱基变异。基于不同葡萄种间的同源miRNA序列比较，在山葡萄上发现了的miRNA SNPs(miR-SNPs)和miRNA长度变异(miR-LDs)，其中一些变异可能改变其靶模式。利用生物信息学方法预测了新的Va-miRNAs的346条靶基因。同源基因功能注解表明，它们主要涉及抗逆过程(抗寒性、抗病性、抗旱性等)、花青素合成及糖代谢等过程。 5.为了从全基因组水平全面认识miRNA在葡萄发育过程中作用模式的时空特性，利用Solexa、Degradome测序及生物信息学方法系统研究了不同发育时期的葡萄叶、花、果组织中Vv-miRNA与靶基因的特性及Vv-miRNA调控靶基因作用模式的时空变化。共鉴定了242条已知的和132条新的miRNA，并验证到193条靶基因，其中103条是已知Vv-miRNA的靶基因，另90条为新Vv-miRNA的靶基因。研究发现，超过50％的新Vv-miRNA在葡萄花、果组织中特异地表达，并在相应组织对其靶基因有特异性地裂解作用，其中花组织中的靶裂解位点具有广泛性。qRT-PCR表达分析发现6条果实的新Vv-miRNA对外源赤霉素(GA)和乙烯处理显著地响应，表明它们参与了与GA和乙烯信号途径相关的葡萄果实发育过程。另一方面，约93.6％的已知miRNA在葡萄发育过程中通过不同作用模式动态调控相应的靶基因，其中不仅存在多个家族的不同成员共同调控靶基因的模式，而且存在miRNA家族的多个成员中只有一个成员在葡萄发育过程中对靶基因起主要调控作用的模式。 本研究较大地丰富了葡萄基因组学研究内容，并为葡萄功能基因组学和葡萄花、果发育的机理研究奠定了重要研究基础。 收起