摘要: 绿豆环氧水解酶能对映归一性水解消旋环氧化物生成单一构型的二醇，在手性合成领域具有重要的应用前景。绿豆中至少存在两种选择性不同环氧水解酶(mbEHA和mbEHB)，本课题组已获得mbEHA(VrEH1)的编码基因vreh1，并对重组酶mbEHA进行了表征。本论文成功... 展开 绿豆环氧水解酶能对映归一性水解消旋环氧化物生成单一构型的二醇，在手性合成领域具有重要的应用前景。绿豆中至少存在两种选择性不同环氧水解酶(mbEHA和mbEHB)，本课题组已获得mbEHA(VrEH1)的编码基因vreh1，并对重组酶mbEHA进行了表征。本论文成功地克隆了另两个环氧水解酶基因vreh2和vrehg。vreh2的开放阅读框（ORF）含957bp，编码318个氨基酸和一个终止子，编码产物与大豆环氧水解酶(Glycinemax，XP_003554634.1，87％)和苜蓿环氧水解酶(Medicagotruncatula，XP_003626245.1，86％)高度同源，但与VrEH1(ADP68585.1)和土豆环氧水解酶(Solanumtuberosum，AAA81892.1的同源性仅有72％和57％。vrehg与vreh1高度相似，均编码319个氨基酸，基因水平同源性为99％，蛋白水平同源度为98％。 成功构建了vreh2和vrehg的表达载体并在大肠杆菌BL21(DE3)进行了表达，IPTG浓度为0.1mM条件下，15℃诱导16小时，VrEH2和VrEHg表达量占菌体总蛋白的25-35％，且主要以不溶的包涵体表达为主。降低诱导剂IPTG浓度、改变菌体破碎用缓冲液pH、更换含可溶性标签的载体和/或表达菌株均不能明显改变vreh2不溶性包涵体表达的状态。Ni-亲和层析一步纯化了重组VrEH2，纯化倍数为925，酶活回收效率为40％。 重组VrEH1和VrEH2的最适pH和最适反应温度分别为7.7，45℃和6.5，30℃。VrEH2对表面活性剂和金属离子不敏感。10％异辛烷对重组VrEH2酶活力没有大的影响，并能明显提高产物的对映体过量值(eep=89％)。VrEH1优先水解(S)-pNSO，其KM，S，KM,R和kcat,S，kcat，R分别为5.5，1.4mM和6.2，0.42s-1;相对应，VrEH2优先水解(R)-pNSO，其KM，S，KM，R和kcat，S，kcat，R分别为1.44，0.019mM和0.13，1.76s-1。VrEH1和VrEH2均优先进攻pNSO的α碳原子，VrEH1的选择性系数为α(R)/β(R)=13/87，α(S)/β(S)=83/17;VrEH2的选择性系数为α(R)/β(R)=7/93，α(S)/β(S)=72/28。 VrEH1和VrEH2对多种含苯环的环氧底物(BGE，PGE等)有活性，活力均比对pNSO高。除VrEH2对3M-PGE有对映会聚性外，VrEH1和VrEH2对其他底物均表现为对映选择性。 收起