摘要: 沙冬青是我国西北荒漠区特有的唯一常绿早生阔叶灌木，具有很强的抗寒和抗旱等抗逆特性。目前对于沙冬青抗逆性分子机理和抗逆基因的分离鉴定集中于抗寒性方面，有关其抗旱基因的分离和鉴定尚未见报道。本论文以蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus... 展开 沙冬青是我国西北荒漠区特有的唯一常绿早生阔叶灌木，具有很强的抗寒和抗旱等抗逆特性。目前对于沙冬青抗逆性分子机理和抗逆基因的分离鉴定集中于抗寒性方面，有关其抗旱基因的分离和鉴定尚未见报道。本论文以蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)为材料，采用SMART(Switching Mechanism At 5'end ofRNA Transcript method)技术构建了其在干旱胁迫下的全长cDNA文库，并对文库中的部分克隆进行了5’端测序和序列分析，为进一步开展表达谱分析和重要抗旱基因的克隆鉴定工作奠定了基础。 实验首先对经典热酚法加以改进，解决了蒙古沙冬青叶片总RNA提取中多糖和多酚类物质污染严重的问题，获得符合建库要求的高质量总RNA。此外，还发现Promega公司的PolyATtract(R)mRNA Isolation Systems更适合于沙冬青mRNA的分离纯化。 以不同干旱胁迫处理的蒙古沙冬青混合mRNA为模板合成cDNA，构建了SMART全长cDNA文库。原始文库的滴度和重组率分别为1.88×107 pfu/mL和97.87%，扩增文库的滴度为4.32x1010pfu/mL；插入片段大小在500~2500 bp之间，表明所建文库质量较高。 将所构建的(r)TripIEx2文库转化成pTriplEx2质粒文库，经菌液PCR鉴定获得3 500个阳性克隆。将其中960个克隆进行5’端测序，共获得875个有效EST序列。将EST序列去载体后进行拼接，获得97个Contig和509个Singlet，总计606个Uiugene。这些Unigene通过功能注释可分成19个大类，其中与蛋白质合成、修饰、转运和降解相关的基因所占比例最高，其次是一些具有普通功能的基因和参与小分子及离子运输与代谢的基因，与能量代谢、基因转录、细胞壁和膜的形成、信号转导、细胞周期、胞内运输和RNA加工与修饰等过程相关的基因也占一定比例。有2,65%的Unigene未得到功能注释。 收起