摘要: 帕金森氏病(Parkinson's disease，PD)是第二大神经退行性疾病，临床上以震颤、肌肉僵硬、行动迟缓以及身体姿势不稳为特征。黑质致密部(substantia nigra pars compacta，SNc)的多巴胺能神经元的进行性丢失和Lewy小体(Lewy body)的形成是其病理特征。... 展开 帕金森氏病(Parkinson's disease，PD)是第二大神经退行性疾病，临床上以震颤、肌肉僵硬、行动迟缓以及身体姿势不稳为特征。黑质致密部(substantia nigra pars compacta，SNc)的多巴胺能神经元的进行性丢失和Lewy小体(Lewy body)的形成是其病理特征。尽管帕金森氏病的病因尚不清楚，一般认为它是多种环境因素和遗传因素相互作用所导致。年龄是帕金森氏病发病的另外的一个重要的因素。在中国65岁以上的人群中，帕金森氏病的发病率为1.7％，和西方发达国家的帕金森氏病的发病率相似。据估计，2005年中国50岁以上的人中有199万帕金森氏病患者。据推算，到2030年患者数将达到499万。随着中国平均寿命的增长，帕金森氏病对我国社会造成的负担已经变大，将来可能会进一步增加。 目前，人们根据大脑底部基底核(basal ganglia)的直接通路(directpathway)和间接通路(indirect pathway)之间的功能活动失调来解释帕金森氏病的病理生理。大脑底部基底核由纹状体(striatum)、苍白球(globuspallidus，GP)、底丘脑核(subthalamic nucleus，STN)以及黑质(substantia nigra，SN)组成。其中，灵长目动物的苍白球又分为外侧苍白球（external segment of the GP，GPe）内侧苍白球(internal segment of theGP，GPi)，分别相当于啮齿目动物的苍白球核和脚桥核(entopeducularnucleus，EP)。而黑质也分为两个部分:黑质致密部(substantia nigra parscompacta，SNc)和黑质疏松部(substantia nigra pars reticulata，SNr)。这些高度紧密联系在一起的神经核团可以被简化为两个通路:直接通路和间接通路。纹状体被视为大脑底部基底核的输入结构，内侧苍白球核黑质疏松部被视为大脑底部基底核的输出结构。输入和输出结构之间通过单突触的直接通路和多突触的间接通路联系在一起。间接通路包括从纹状体到苍白球和苍白球到底丘脑核的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA）能神经纤维投射，以及从底丘脑核到内侧苍白球和黑质疏松部的谷氨酸(glutamate，Glu)能神经纤维投射。根据这个体系，在生理情况下，从黑质投射到纹状体的多巴胺能神经末梢释放的多巴胺通过作用于D1多巴胺受体(dopamine receptors)和D2多巴胺受体，分别增加直接通路的功能活动和减少间接通路的功能活动。它的净作用就是抑制内侧苍白球和黑质疏松部的电活动，进而使接受大脑底部基底核投射的靶核团去抑制，从而易化运动的发生。在帕金森氏病中，黑质致密部的多巴胺能神经元选择性和进行性得丢失，导致背侧纹状体多巴胺缺失。它的后果就是直接通路的活动减少和间接通路的活动增加。净作用就是增加内侧苍白球和黑质疏松部的电活动，进而抑制接受大脑底部基底核投射的靶核团，从而抑制运动的发生。随着有关大脑底部基底核的解剖数据的累积，现在普遍认为这个经典体系太过简单，大脑底部基底核核团之间的联系要远比这个体系复杂。 的确，即使是纹状体中的直接通路中的中型多棘神经元(medium spinyneurons，MSNs)（也叫D1 MSNs）和间接通路中的中型多棘神经元(也叫D2 MSNs)之间也是通过回返性轴突侧枝联系在一起。苍白球中的γ-氨基丁酸能神经元的轴突末梢也投射到大脑底部基底核得各个部分。而且，黑质致密部的多巴胺能神经元的轴突末梢也投射到纹状体、外侧苍白球、底丘脑核和内侧苍白球。同时，它们还通过树突在黑质疏松部释放多巴胺。因此，在帕金森氏病中，黑质致密部的多巴胺能神经元的进行性丢失会导致整个大脑底部基底核的多巴胺缺失，其中包括纹状体和苍白球。长期以来，人们一直认为纹状体背部多巴胺的缺失是帕金森氏病的主要病变，而除纹状体以外的大脑底部基底核的多巴胺缺失也可能是帕金森氏病的症状的原因。纹状体和外侧苍白球的多巴胺缺失的后果还没有完全研究清楚。在本文的研究中，我们试图阐明多巴胺缺失对中型多棘神经元之间的回返性轴突侧枝联系和纹状体和苍白球之间的γ-氨基丁酸能神经纤维传递的影响。以往有研究表明，在纹状体多巴胺缺失后，D1和D2多巴胺受体对多巴胺调节变得超级敏感。又有研究显示，中型多棘神经元之间的回返性轴突侧枝联系和纹状体和苍白球之间的γ-氨基丁酸能神经纤维传递都受到多巴胺的调节。因此，我们的研究假设是:在多巴胺缺失后，中型多棘神经元之间的回返性轴突侧枝联系和纹状体和苍白球之间的γ-氨基丁酸能神经纤维传递对多巴胺的调节更加敏感。 为了验证我们的假设，我们采用了一种新的帕金森氏病模型小鼠，Pitx3基因突变小鼠（简称Pitx3突变型纯合子小鼠）。这种品系的小鼠天生缺失黑质致密部的多巴胺能神经元。纹状体背部的多巴胺的缺失也达到90％。这种小鼠的从黑质到纹状体的多巴胺能神经通路的特点和帕金森氏病的晚期特点相似。而且，Pitx3突变型纯合子小鼠还显示出和帕金森氏病的症状类似的行动障碍。和传统的由毒素诱导的帕金森氏病动物模型相比，Pitx3突变型纯合子鼠体现出很多优势，以及一些互补的特征。 第一，神经毒素非特异性损毁投射到纹状体的黑质多巴胺能神经元，并且存在个体差异和明显的修复。相反，在Pitx3突变型纯合子小鼠中，黑质致密部的多巴胺能神经元丢失的更完全、更可靠，而且不可逆。 第二，在传统的神经毒素诱导的帕金森氏病动物模型中，整个纹状体的多巴胺能神经末梢都丢失了。而在Pitx3突变型纯合子小鼠中，只有纹状体背部的多巴胺能神经末梢才丢失，纹状体腹部的多巴胺能神经末梢并未丢失。 第三，Pitx3突变型纯合子小鼠适合电生理实验，因为绝大部分神经毒素诱导的帕金森氏病动物模型都是使用成年动物，而在成年动物上做膜片钳实验非常困难。和其它的转基因鼠帕金森氏病模型相比，Pitx3突变型纯合子小鼠也有独到的优势。在所有的转基因鼠帕金森氏病模型中，只有Pitx3突变型纯合子小鼠的黑质致密部的多巴胺能神经元有选择性丢失。在其它的转基因鼠帕金森氏病模型中，只有到了晚期才有轻微的黑质致密部的多巴胺能神经元丢失。Nurr1基因敲除鼠纯合子也没有黑质致密部的多巴胺能神经，但是这种鼠出生不久就会死亡，因而限制了它在研究中的应用。因此，我们利用了Pitx3突变型纯合子小鼠帕金森氏病模型的优点，进行了下面的实验研究。 第一部分实验是研究多巴胺对纹状体背部的中型多棘神经元之间的回返性轴突侧枝联系的调节。纹状体中的神经元有90％以上是中型多棘神经元。从功能上可以把它们分开为两类:直接通路中型多棘神经元或者是D1中型多棘神经元和间接通路中型多棘神经元或者是D2中型多棘神经元。这两类中型多棘神经元相互交织在一起，从形状难以区分开来。我们利用了另外一种转基因鼠。在这种转基因鼠中，D2中型多棘神经元表达有增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreen fluorescent protein)（此后称之为D2 EGFP小鼠）。我们用Pitx3突变型纯合子小鼠和D2 EGFP小鼠杂交，产生了另外两种基因型:Pitx3突变型纯合子/D2 EGFP小鼠和Pitx3野生型纯合子/D2 EGFP小鼠。我们采用双膜片钳记录方式来研究Pitx3野生型纯合子/D2 EGFP小鼠和Pitx3突变型纯合子/D2EGFP小鼠纹状体背部的中型多棘神经元之间的回返性轴突侧枝联系。首先，我们比较了Pitx3野生型纯合子/D2 EGFP小鼠和Pitx3突变型纯合子/D2 EGFP小鼠纹状体背部的中型多棘神经元之间的回返性轴突侧枝联系概率。接下来我们对比了Pitx3野生型纯合子/D2 EGFP小鼠和Pitx3突变型纯合子/D2 EGFP小鼠的纹状体背部的中型多棘神经元之间的回返性轴突侧枝突触的抑制性突触后电流（inhibitory postsynaptic currents, IPSCs）的峰值。然后，我们比较了在Pitx3野生型纯合子/D2 EGFP小鼠和Pitx3突变型纯合子/D2 EGFP小鼠中多巴胺对纹状体背部的中型多棘神经元之间的回返性轴突侧枝突触的调节。最后，我们用了低剂量的左旋多巴在Pitx3突变型纯合子/D2 EGFP小鼠出生后的第10天(P10)对其进行治疗。我们是根据我们实验室中行为学研究的数据来确定左旋多巴的剂量和给药的时间。我们发现: 1.在Pitx3野生型纯合子/D2 EGFP小鼠和Pitx3突变型纯合子/D2 EGFP小鼠中，纹状体背部的中型多棘神经元之间的回返性轴突侧枝联系是和D1以及D2多巴胺受体关联在一起的。D1中型多棘神经元与D1中型多棘神经元之间的联系要比与D2中型多棘神经元之间的联系多，而D2中型多棘神经元与D2中型多棘神经元之间的联系要比与D1中型多棘神经元之间的联系多。在Pitx3野生型纯合子/D2 EGFP小鼠中，纹状体背部的D1中型多棘神经元与D1及D2中型多棘神经元之间的联系率分别是42.55％和8％，D2中型多棘神经元与D2及D1中型多棘神经元之间的联系率分别是54.29％和24％。和Pitx3野生型纯合子/D2 EGFP小鼠相似，在Pitx3突变型纯合子/D2 EGFP小鼠中，纹状体背部的D1中型多棘神经元与D1及D2中型多棘神经元之间的联系率分别是41.86％和5％，D2中型多棘神经元与D2及D1中型多棘神经元之间的联系率分别是63.41％和35％。在Pitx3野生型纯合子/D2 EGFP小鼠和Pitx3突变型纯合子/D2 EGFP小鼠中，D1中型多棘神经元与D1中型多棘神经元之间的联系率要显著地高于D1中型多棘神经元与D2中型多棘神经元之间的联系率（卡方检验，P＜0.001），而D2中型多棘神经元与D2中型多棘神经元之间的联系率要显著地高于D2中型多棘神经元与D1中型多棘神经元之间的联系率（卡方检验，P＜0.01）。 2.纹状体背部的中型多棘神经元之间的回返性轴突侧枝联系概率以及纹状体背部的中型多棘神经元之间的回返性轴突侧枝突触的抑制性突触后电流的峰值在Pitx3野生型纯合子/D2 EGFP小鼠和Pitx3突变型纯合子/D2 EGFP小鼠之间没有显著差别（在Pitx3野生型纯合子/D2 EGFP小鼠和Pitx3突变型纯合子/D2 EGFP小鼠中，D1中型多棘神经元与D1中型多棘神经元之间的联系率分别是42.55％和41.86％，卡方检验，P=0.670＞0.05; D2中型多棘神经元与D2中型多棘神经元之间的联系率分别是54.29％和63.41％，卡方检验，P=0.290＞0.05; D1中型多棘神经元与D2中型多棘神经元之间的联系率分别是8％和5％，卡方检验，P=0.446＞0.05; D2中型多棘神经元与D1中型多棘神经元之间的联系率分别是24％和35％，卡方检验，P=0.273＞0.05）。这些结果表明，纹状体背部的多巴胺缺失并没有影响到中型多棘神经元之间的联系概率。 3.多巴胺和D1多巴胺受体激动剂可以增加Pitx3野生型纯合子小鼠中纹状体背部的D1中型多棘神经元与D1中型多棘神经元之间的抑制性突触后电流的峰值。50μM多巴胺可以使该峰值增加117.3±40.8％(配对t检验，P=0.044＜0.05)，而1μM SKF81297，一种D1多巴胺受体激动剂，可以使该峰值增加63.87±40.40％（配对t检验，P=0.049＜0.05）。这些作用是通过作用于突触前的D1多巴胺受体，因为在浴液给多巴胺的过程中，双脉冲比率(paired pulse ratio，PPR)降低了约30％。但是，在Pitx3突变型纯合子/D2EGFP小鼠中，多巴胺和D1多巴胺受体激动剂就没有这种作用。50μM多巴胺可以使该峰值增加4.20±3.20％（配对t检验，P=0.462＞0.05），而1μMSKF81 收起