摘要: 药用植物长春花(Catharanthus roseus)含有文朵灵(Vindoline)、长春质碱(Catharanthine)、长春碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)等130多种具有重要药理活性的萜类吲哚生物碱(Terpenoid indole alkaloids，TLAs)。长春花中生物碱含量普遍较低，... 展开 药用植物长春花(Catharanthus roseus)含有文朵灵(Vindoline)、长春质碱(Catharanthine)、长春碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)等130多种具有重要药理活性的萜类吲哚生物碱(Terpenoid indole alkaloids，TLAs)。长春花中生物碱含量普遍较低，长春花的毛状根和悬浮细胞又不能合成具有抗肿瘤活性的重要萜类吲哚生物碱长春碱和长春新碱。目前国内外大多是通过提取长春花中含量相对较高的文多灵和长春质碱，再在此基础上通过化学半合成长春碱和长春新碱。由于生物碱结构复杂，人工合成难度大、产量低、成本高，使得长春碱等重要生物碱的大规模商业化生产受到了限制。因此，利用代谢工程策略提高长春花中重要生物碱长春碱等含量对其商业化生产是十分必要的。 本研究建立了根癌农杆菌介导的长春花遗传转化体系，并在长春花中过量表达了TIAs生物合成途径中的关键酶基因str和dat。同时，为了深入研究dat基因的表达调控，对其启动子进行了克隆，并测定了不同启动子片段的转录活性，确定了dat基因启动子中对甲基茉莉酸应答的主要元件。本研究得到了如下结果： (1)建立了根癌农杆菌介导的长春花遗传转化体系。 通过对转化体系的优化，建立了根癌农杆菌介导的长春花遗传转化体系。长春花遗传转化的最佳条件为：以长春花下胚轴为外植体，超声波处理功率80 W，处理时间10 min，农杆菌浓度OD600=0.8，侵染时间30min，1/2 MS培养基(添加100μmol/L AS)共培养2d。通过研究共获得了12株独立的转GUS基因的转基因长春花植株，转化率在1.11%～11.11%之间。 (2)构建了含TIAs生物合成途径关键酶基因dat和str的单基因和双基因植物表达载体(pCAMBIA2300-dat，pCAMBIA2300-str-dat)，采用农杆菌介导法转化长春花下胚轴，获得了40株单转dat基因的转基因长春花植株、10株共转str和dat基因的转基因长春花植株；Real-timePCR分析结果表明外源基因己在转基因长春花植株中表达；HPLC分析表明，转基因长春花中重要生物碱文多灵、长春质碱和长春碱含量显著提高。其中，转dat基因的转基因长春花植株中文多灵、长春质碱和长春碱含量最高分别为对照（非转基因植株）的1.92、1.42和16.70倍。共转dat和str基因的转基因长春花植株中文多灵、长春质碱和长春碱含量最高分别为对照的2.48、3.45和17.13倍。 (3)采用Genomic DNA Walking技术分离了dat基因的启动子（长度为1773 bp）。采用5'-RACE技术确定了dat基因的转录起始位点，发现其位于起始密码子ATG上游13bp的位置，该碱基为A。序列分析结果表明，TATA box位于距离转录起始位点-27 bp～-34 bp的位置，并且启动子中存在许多与其它基因启动子序列同源的功能元件。随后，构建了一系列5’端缺失以及对甲基茉莉酸应答元件缺失的dat基因启动子与GUS基因融合的表达载体，并利用其在长春花悬浮细胞中的瞬时表达分析了启动子上的顺式作用元件；测定了转化后悬浮细胞中GUS蛋白的表达活性，发现dat基因启动子中重要的调节转录增强元件位于-252 bp～-120 bp之间。通过甲基茉莉酸处理，确定了在dat启动子-1112 bp～-808 bp之间存在的TGACG-motif为甲基茉莉酸的主要应答元件。 收起