摘要:
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一类引起人类乙型病毒性肝炎的DNA病毒。目前，全世界大约有400万人感染HBV病毒，HBV的感染最终会导致肝功能衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。在HBV感染过程中，HBV病毒抗原，如HBsAg、HBcAg、HBeAg，均可诱导机...
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乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一类引起人类乙型病毒性肝炎的DNA病毒。目前，全世界大约有400万人感染HBV病毒，HBV的感染最终会导致肝功能衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。在HBV感染过程中，HBV病毒抗原，如HBsAg、HBcAg、HBeAg，均可诱导机体产生抗原特异性T细胞免疫反应，包括多种具有特异性抗病毒效应的辅助性T细胞和自然杀伤性T细胞，对于控制病毒的感染至关重要。然而，慢性乙型病毒性肝炎患者常表现为HBV特异性T细胞免疫反应受损，从而导致病毒感染的持续和慢性化进展。最近，CD4+Th细胞家族新型成员-Th17细胞亚群的发现，改写了经典的Th1/Th2细胞免疫模式。这类细胞主要以分泌IL-17(IL-17A)、IL-17F、IL-21、IL-22等细胞因子为特征，其增殖、分化过程需要IL-6和TGF-β的参与，并且需要STAT3依赖性的转录因子RORγt、RORα的表达。Th17细胞免疫反应在肿瘤免疫以及多种自身免疫性疾病的免疫发病过程中发挥重要作用。在病毒感染性疾病方面，抗原特异性Th17细胞反应已被证实参与HCV感染后病毒的清除过程，并且发现在慢性乙型病毒性肝炎患者外周血循环中检测到的高表达的Th17细胞亚群与疾病的进展及肝脏的炎症损伤程度密切相关。尽管如此，在人类慢性乙型肝炎病情进展过程中，宿主对病毒特异性Th17细胞免疫反应的调节机制仍未明了。本课题旨在研究Th17细胞亚群在慢性乙型肝炎患者体内的表达水平，以及与病情进展和炎症状态的相关性；探析免疫抑制分子IL-10和免疫调节细胞CD4+CD25+调节性T细胞对HBV抗原特异性Th17细胞的调控作用，揭示转录因子Foxp3和RORγt分子参与调控HBV抗原特异性Th17细胞分化的可能机制，这对于阐明HBV感染宿主对Th17细胞的免疫调控机制，寻求慢性HBV感染特异性免疫治疗的新思路和新方法具有重要意义。本研究共分为三个部分。 第一部分：慢性乙型肝炎患者外周血循环Th17细胞亚群的检测及临床研究。 目的：研究慢性乙型肝炎患者外周血循环Th17细胞亚群在不同病情状态下的差异表达，并分析其与临床炎症损伤指标的相关性，探讨Th17细胞参与机体抗HBV感染免疫的临床意义。 方法：采集40例慢性乙型肝炎中度(CHB，Mild)，37例慢性乙型肝炎重度(CHB，Severe)以及36例健康对照者的外周血单个核细胞(PBMC)，通过流式细胞染色技术分析PBMC中Th17亚群细胞的表达频率。ELISA方法检测部分患者HBV血清标记物和血清IL-10水平，同时进行肝功能(ALT)检测。 结果：①慢性乙型肝炎重度患者外周血循环中Th17细胞亚群的百分比(2.42±0.66％)明显高于慢性乙型肝炎中度患者(1.94±0.78％)及健康对照者(2.02±0.69％)，且差异具有显著性(P<0.05)。②慢性乙型肝炎患者及健康人外周血循环中可以检测到分泌IL-17的CD8+T细胞亚群(Tc17细胞)，且慢性乙型肝炎重度患者(0.121±0.120％)外周血循环中Tc17细胞亚群百分比明显高于健康对照者(0.079±0.065％)，差异具有显著性(P<0.05)。③慢性乙型肝炎患者外周血循环Th17细胞亚群百分比与血清ALT水平成正相关性(r=0.394，P=0.000)。④慢性乙型肝炎患者血清IL-10水平与外周血循环Th17细胞亚群百分比成负相关性(r=-0.452，P<0.01)。 结论：⑴与健康人相比，慢性乙型肝炎患者外周血循环Th17细胞亚群的表达水平明显增高；⑵乙型肝炎病毒感染患者外周血循环中存在高表达、可分泌IL-17的CD8+T细胞亚群；⑶慢性乙型肝炎患者外周血循环中Th17细胞亚群可能参与肝脏炎症损伤中促炎的病理过程；⑷IL-10可能参与慢性乙型肝炎病毒感染机体外周血循环中Th17细胞的调节过程。 第二部分：IL-10对慢性乙型肝炎患者HBcAg诱导的Th17细胞亚群免疫调控机制的研究。 目的：Th17细胞已被证实在宿主抗病毒感染的免疫过程中发挥了重要作用，然而，在HBV感染过程中宿主对Th17细胞亚群功能的调控机制知之甚少。本实验通过研究IL-10对慢性乙型肝炎患者外周血循环中Th17细胞亚群的调节作用，探讨IL-10参与调节HBV诱导的特异性Th17细胞免疫反应的可能机制。 方法：采集慢性乙型肝炎患者外周血标本分离PBMC，在rHBcAg体外诱导培养过程中，分别给予rIL-10和anti-IL-10抗体进行干预后，流式细胞仪检测培养细胞中Th1、Th17细胞亚群的百分比变化，同时利用流式微珠阵列法检测培养上清中相关细胞因子(IL-10、IL-17A、IL-22、IL-23、IL-6、TGF-β)的分泌量，蛋白质印记法检测CD4+T细胞RORγt分子的表达水平。 结果：①慢性乙型肝炎PBMC中可以检测到rHBcAg诱导的Th1、Th17细胞亚群百分比增加，而在健康人PBMC中没有明显改变；②rHBcAg可以诱导慢性乙型肝炎患者的PBMc分泌Th17型相关细胞因子IL-17A、IL-22、IL-23、IL-6、TGF-β和免疫抑制因子IL-10；③慢性乙型肝炎患者的PBMC在体外培养过程中，给予rIL-10干预，可以抑制rHBcAg诱导IL-17A、IL-22、IL-23、IL-6的分泌，而对TGF-β的分泌量无影响。同时，rIL-10干预可以下调慢性乙型肝炎患者PBMC中rHBcAg诱导的Th17细胞百分比；④Anti-IL-10抗体干预后可上调慢性乙型肝炎患者PBMC中Th1、Th17细胞百分比，同时，伴有Th17型相关细胞因子IL-17A、IL-22、IL-23、IL-6的分泌增加和CD4+T细胞RORγt表达上调，但并不影响培养细胞TGF-β的分泌和CD4+CD25+T细胞表达Foxp3。 结论：⑴在慢性乙型肝炎患者，HBcAg不仅诱导致炎性Th1、Th17型细胞免疫反应，同时刺激免疫抑制因子IL-10的分泌增加；⑵IL-10通过抑制IL-6的分泌以及下调CD4+T细胞上RORγt分子的表达，发挥对HBcAg诱导的Th17细胞免疫反应的抑制作用；⑶IL-10对HBcAg诱导的Th17细胞免疫反应的抑制作用与表达Foxp3的CD4+CD25+调节性T细胞的参与无关。 第三部分：CD4+CD25+调节性T细胞对慢性乙型肝炎患者HBcAg诱导的Th17细胞亚群免疫调控机制的研究。 目的：Th17细胞和CD4+CD25+调节性T细胞是参与慢性HBV感染宿主体内抗病毒感染的免疫过程中重要的效应细胞。然而，HBV感染过程中CD4+CD25+调节性T细胞对Th17细胞亚群功能的调节作用尚未明确。本实验通过研究CD4+CD25+调节性T细胞对慢性乙型肝炎患者外周血循环中Th17细胞亚群的调控现象，探讨CD4+CD25+调节性T细胞参与调节HBV诱导的特异性Th17细胞免疫反应的可能机制。 方法：采集16名慢性乙型肝炎患者和18名健康人外周血标本分离PBMC，流式细胞仪检测Th17细胞、CD4+CD25+调节性T细胞亚群的百分比，并进行两者相关性分析。利用CD4+CD25+调节性T细胞分选技术去除PBMC中CD4+CD25+调节性T细胞以及Foxp3 siRNA干扰技术抑制PBMC中Foxp3分子表达水平，观察CD4+CD25+调节性T细胞对HBcAg诱导的Th17细胞表达的调控现象。 结果：①慢性乙型肝炎外周血循环Th17和CD4+CD25+调节性T细胞百分比均高于健康人(CD4+CD25+调节性T细胞：8.2±4.29％vs.6.59±1.56％；P<0.01；Th17细胞：1.4±0.59％vs.1.16±0.36％，P<0.01 by the student T test)；②慢性乙型肝炎外周血循环中Th17与CD4+CD25+调节性T细胞的表达水平呈负相关性(r=-0.590，P=0.026)；③去除慢型乙型肝炎患者PBMC中CD4+CD25+调节性T细胞，可明显增加rHBcAg诱导培养细胞中Th17细胞百分比，差异具有显著性(3.71±0.53％vs.6.13±0.52％，P=0.0057 by the student T test)。④利用Foxp3 siRNA干扰技术抑制慢型乙型肝炎患者PBMC中Foxp3分子表达水平，培养细胞中rHBcAg诱导的Th17细胞百分比明显增高，且差异具有显著性。 结论：⑴在慢性乙型肝炎患者外周血循环中，Th17细胞亚群和CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞亚群表达均高于健康人，且两者表达水平具有一定的负相关性。⑵在慢性HBV感染过程中，CD4+CD25+调节性T细胞可以抑制HBcAg诱导的Th17细胞亚群的增殖、分化作用。⑶CD4+CD25+调节性T细胞高表达的Foxp3分子参与宿主对HBcAg诱导的Th17细胞亚群增殖、分化的抑制过程。
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