摘要: 低温是影响植物生长的主要逆境因子之一，不仅限制植物的地理分布，而且通过缩短植物的生长季节减少植物产量，每年给全球农作物带来数十亿美元的经济损失。自然界植物响应低温胁迫分为三个阶段：冷驯、冻、融，目前对低温胁迫分子机制的大量深入研究... 展开 低温是影响植物生长的主要逆境因子之一，不仅限制植物的地理分布，而且通过缩短植物的生长季节减少植物产量，每年给全球农作物带来数十亿美元的经济损失。自然界植物响应低温胁迫分为三个阶段：冷驯、冻、融，目前对低温胁迫分子机制的大量深入研究主要是集中在零上低温阶段，对于零下低温冻的阶段研究较少，从零下低温回升至零上温度的融这一阶段的研究更是鲜见报导。本实验室前期研究结果提示植物对冻融的响应是复杂且重要的，并非仅仅是对冻害的被动响应，也有一些关键的主动响应作用，在基因表达、信号通路和膜脂变化上都有特殊的规律，这些规律的深入研究有助于认识植物对低温胁迫的响应和提高植物的抗逆性。本文以模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)及其具有优越抗逆性状的近缘种小盐芥(Thellungiella halophlia)为研究对象，在对植物抗冻性起关键作用的基因表达调控、信号传导通路和膜脂分子变化三个层次上研究了植物响应冻融胁迫的机制，得到以下五方面结果。 第一，获得拟南芥在冻融胁迫中转录组水平的响应，并鉴定3个与冻融过程相关的功能基因。我们从低温胁迫全过程的转录组研究着手，发现冻融阶段基因表达变化最剧烈，进而对差异基因进行表达趋势、功能以及Pathway分析，也得出冻融过程可能是低温胁迫关键阶段的结论。因而，我们进一步对冻融胁迫分解细化后进行转录组研究，发现冻融过程的差异表达基因调控方式以上调为主要趋势，而且融阶段差异表达基因数目远远超过冻阶段。而显著性功能和显著性Pathway分析也显示，融阶段相对于冻阶段更多的发生了一些基因表达调控和信号传递的事件，所启动的调控机制对植物遭遇冻融胁迫后的命运发挥了更重要的作用。为进一步鉴定功能基因，我们针对转录组研究中得到的关键基因采用缺失突变的方法探讨了其在冻融过程中实际发挥的功能，发现Atlg12610和At2g40350两个基因在冻融过程中发挥负调控作用，而hsp101基因在冻融胁迫中发挥了正调控作用。 第二，得到冻融过程差异表达基因中高频出现的顺式元件，验证其中个别元件在冻融过程的实际结合作用，并进一步预测了可能响应冻融胁迫的新元件。前述转录组调控网络的分析结果显示处于冻融过程调控中心地位的基因半数以上都是转录因子，说明顺式元件与转录因子之间的应答调控是冻融胁迫分子机制中的重要内容，因而我们对冻融过程中表达发生剧烈变化的160个基因进行了启动子区顺式元件研究。我们发现目标基因中除包含四大类已报导的低温调控基因相关元件，同时还存在大量已知功能与低温无关或不直接相关的元件，据此我们推测植物响应冻融的分子机制中可能蕴藏了与植物生长发育多个方面的Crosstalk。进一步分析还发现多种激素响应元件都在目标基因中高频出现，这暗示我们激素介导的复杂调控通路极有可能是植物响应冻融胁迫分子机制的重要内容之一。为验证通过生物信息学方法分析所得到的顺式元件在冻融过程中实际发挥的作用，我们选定Amylase element作为元件代表，应用ElectrophoreticMobility Shift Assay的实验方法鉴定了它在冻融过程中的结合作用，结果还证明，Amylase element可能主要是在冷驯、融和去冷驯的过程中通过结合更多的特定转录因子发挥了调控作用。除了已知元件的研究，我们还预测了可能响应冻融胁迫的新元件，得到在目标基因启动子中高频出现的寡核苷酸片段，如“CGTCGGC”等，这些片段的显著高频出现可能正是体现了对冻融胁迫的响应，进一步确证新元件的工作还在继续中。 第三，初步了解microRNA对拟南芥响应冻融胁迫的调控，得到36个冻融过程中可能受到microRNA调控的功能基因。miRNA的转录后水平调控功能为研究植物响应非生物胁迫的分子机制研究开辟了一个新的视野，通过对冻融过程中miRNA研究，筛选得到18个差异表达的miRNA基因，它们的变化幅度都相对较小，且调控方式以下调为主。应用生物信息学方法我们预测了miRNA的靶基因，得到36个可能在冻融过程中受到miRNA调控的功能基因，将这些靶基因与前述转录组研究中得到的差异表达基因进行关联分析，发现6个靶基因是在转录组检测中确定发生了表达变化的，而其中3个都是由miR835靶向的，这提示我们miR835可能是miRNA家族在冻融过程中发挥作用的一个重要成员。通过功能注释可以看出，这6个靶基因未知性较强，这为我们探究其在冻融过程中扮演的角色留下了足够空间。 第四，鉴定了植物激素Auxin对拟南芥响应冻融胁迫的负调控作用。基于前期对冻融过程中转录组响应的研究，我们从表达受冻融强烈调控的基因中发现了5个与Auxin相关的基因，且这五个基因表达变化趋势一致，均受冻融过程下调。而顺式元件的研究结果也显示冻融过程差异表达基因中存在若干与响应Auxin相关的顺式元件，因此我们推测Auxin可能参与了响应冻融胁迫的信号通路。进而我们通过在冻融过程中对植株施加外源Auxin，发现Auxin的施加降低了拟南芥对冻融过程的抗性。同时，应用上述Auxin相关基因的缺失突变株进行冻融处理发现突变株比野生型具有更强的抗冻能力。而检测拟南芥内源Auxin水平也显示冻融过程中IAA水平显著下降。进一步对野生型植株中Auxin调控基因的表达水平检测显示，三个基因在经历冻融胁迫后都被诱导下调。综合以上实验结果说明，Auxin在拟南芥响应冻融胁迫中发挥了负调控作用，而当植物遭遇冻融胁迫时会主动降低内源Auxin水平，进而下调某些Auxin调控基因，以尽可能削弱Auxin在冻融胁迫中引起的负面效应。 第五，揭示了抗冻植物小盐芥在冻融胁迫中膜脂组成变化规律。生物膜是低温诱导伤害发生的首要位点，植物对低温胁迫的抗性很大程度上依赖于膜抵抗低温伤害并维持自身完整性的能力，因而除了从基因调控和信号通路研究植物对冻融胁迫的响应，我们还以极端生境植物小盐芥为材料，在细胞水平研究与冻融抗性相关的膜脂特征。通过将冻融过程中小盐芥膜脂组成变化规律与已报导的拟南芥膜脂变化进行对比，我们发现了小盐芥独有的一些特性：磷脂酸(PA)在冻时会迅速上升，而当温度回升到零上融时又迅速降回到冻前水平；溶血磷脂和叶绿体膜脂在整个冻融过程都基本保持稳定；磷脂酰胆碱相对于磷脂酰乙醇胺(PC/PE)的比例增高；脂肪酸双键增加等。基于对比分析得到的这些特性我们从膜脂水平总结了可能与小盐芥抗冻相关的机制：一是膜脂准确迅速的传递了环境信号；二是生物膜稳定的维持自身完整性的能力。 概言之，本文首次从基因调控和信号通路的角度对冻融胁迫进行了较为深入系统的研究，并辅之抗冻植物的膜脂特征研究，所得到的研究结果帮助我们更深刻的认识了冻融过程，丰富了低温胁迫全过程的研究体系，促进了对低温胁迫认识的完整性，同时还具有为提高植物抗低温能力的改良工程提供更宽广更优化选择的实践意义。 收起