摘要: 目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离、培养、传代扩增的实验方法；将hBCL-2和hVEGF165双基因共表达重组腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞，检测目的基因的表达及表达产物的生物学效应，为后续动物实验及临床应用提供理论基础。 方... 展开 目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离、培养、传代扩增的实验方法；将hBCL-2和hVEGF165双基因共表达重组腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞，检测目的基因的表达及表达产物的生物学效应，为后续动物实验及临床应用提供理论基础。 方法：⑴取SD大鼠的股骨、胫骨，用高糖型高糖型DMEM细胞培养基反复多次冲洗骨髓腔，将冲洗液移入转移到培养瓶培养，贴壁法分离、培养、传代BMSCs，显微镜观察细胞的形态变化和生长分化情况。⑵收集第三代（P3）细胞流式细胞仪鉴定表面抗原决定族（CD）。用相同浓度不同体积的重组腺病毒液转染间充质干细胞，流式细胞仪检测绿色荧光蛋白的表达，获得最佳感染复数（MOI）。⑶以最佳感染复数转染骨髓间充质干细胞，裂解细胞并提取总RNA，设计hBCL-2及hVEGF165特异性引物，通过PCR从mRNA水平验证目的基因在间充质干细胞中的表达。然后，收集转染后细胞的培养上清液，用ELISA法检测分泌性蛋白VEGF165在细胞培养上清液中的浓度；同时裂解转染重组腺病毒后的细胞提取总蛋白，用Western Blot的方法检测胞内蛋白BCL-2的表达量，从而在蛋白水平上检测这两个基因的表达强度。⑷用MTT法及Annexin V-PE/7-AAD法分别观察双基因转染对骨髓间充质干细胞增殖及凋亡的影响。 结果：①大鼠骨髓间充质干细胞分离纯化成功，可观察到原代细胞呈长梭形、多角形，传代后细胞增殖速度明显加快，3天后细胞覆盖率90%左右，经过传代培养得到足够数量且状态良好的细胞进行实验。②应用流式细胞仪检测BMSCs的表面标志物，，显示CD29、CD44、CD90阳性，而CD34、CD45阴性，符合BMSCs细胞表面特征。用不同体积重组腺病毒液转染大鼠骨髓间充质干细胞，经过流式细胞仪的检测，得到最佳感染复数为400。③重组腺病毒以最佳感染复数转染BMSCs在mRNA水平，检测到转染后的BMSCs可表达这两个外源基因。用ElisaELISA试剂盒检测到，转染后细胞培养上清液VEGF165峰浓度达到924.3±56.5pg/ml，多个时间点与对照组相比，它们之间的浓度差异有统计学意义（P<0.05）；Western Blot也检测到转染后细胞BCL-2蛋白表达量明显比对照组增加（P＜0.05）。④MTT比色法观察到，含有转染细胞分泌的VEGF165上清液可促进BMSCs的增殖（P＜0.05）；用Annexin V-PE/7-AAD检测转染后间充质干细胞的凋亡率，与对照组相比有统计学意义（P＜0.05）。 结论：⑴本实验室构建制备的hBCL-2及hVEGF165双基因共表达重组腺病毒载体可成功转染大鼠骨髓间充质干细胞。⑵转染重组腺病毒载体的间充质干细胞能够表达目的基因hBCL-2及hVEGF165，并且表达产物具有明显的生物学效应。 收起