摘要: 棉花黄萎病是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）侵染引起的真菌性维管束系统病害，是棉花最严重的病害之一，给我国棉花生产造成严重损失，被称为“棉花的癌症”。目前以菌治菌的生物防治被认为是一种最具有发展潜力的有效防治方法。 本研究从棉... 展开 棉花黄萎病是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）侵染引起的真菌性维管束系统病害，是棉花最严重的病害之一，给我国棉花生产造成严重损失，被称为“棉花的癌症”。目前以菌治菌的生物防治被认为是一种最具有发展潜力的有效防治方法。 本研究从棉花根际土壤中分离到的891株细菌菌株中筛选出对大丽轮枝菌的生长有抑制作用的89株，其中10株拮抗菌株的无菌体发酵液表现拮抗活性，说明10株拮抗菌株主要是通过产生抗生类物质来抑制大丽轮枝菌的生长，其中DM-54菌株的活性最高。经进一步分析发现 DM-54菌株所分泌的抗生类物质属于蛋白质类。DM-54菌株发酵液分别对12种病原菌进行抑菌实验，结果表明对其中大丽轮枝（Verticillium dahliae Kleb），胶胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz），串珠镰孢菌（Fusarium moniliforme Sheld），剑兰炭疽（Glomerella cingulata）等8种病原菌有较高的拮抗活性，属较广抗菌谱的细菌，生防应用前景广阔。 通过结合形态特征、生理生化反应及16S rDNA基因序列分析确定DM-54菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。 对解淀粉芽孢杆菌B. amyloliquefaciens DM-54菌株产抗菌物质的液态发酵条件进行优化，确定DM-54菌株发酵产抗菌蛋白最适发酵培养基为：糊精5％，大豆蛋白胨3％，MgSO40.02％，CaCl20.01％，初始pH7.0；250 mL三角瓶装液量30 mL，种龄16h，接种量10％，摇床转速200 r/min，发酵温度32℃，发酵时间48 h。优化前后蛋白抑菌活性差别明显，优化之前抑菌圈直径16.3 mm，优化后22.8 mm。 芽孢是微生物菌剂的最佳制剂形式，对恶劣的环境因素的具有抗性，可延长制剂保存期，稳定活性。对B.amyloliquefaciens DM-54菌株产芽孢条件进一步进行摸索，产芽孢最适发酵培养基为：乳糖0.5％、黄豆饼粉2.0％、MnSO4·H2O0.3％、培养液初始pH值为7.5；种龄18 h、装液量50 mL/250 mL、接种量10％、发酵时间36 h、温度为30℃、转速为220 r/min。在此优化条件下，DM-54菌株发酵液中的菌体芽孢形成率大大提高，最终生物量达到2×109个/mL，芽孢形成率达到98.3％。 通过盆栽实验，考察棉花黄萎病拮抗细菌DM-54菌株在土壤中的定殖情况及在棉花根内的定殖情况。本实验分别对灭菌土和非灭菌土这两种土样进行拮抗菌的浸种、全部混土和部分混土三种不同处理进行盆栽实验。结果表明，30d后拮抗细菌DM-54菌株能够在灭菌土和非灭菌中定殖，定殖数量达106 cfu/g土左右，经过30 d后并保持较高的抑菌活性，并且菌株在灭菌土中的定殖数量高于非灭菌土中的数量。施用方法中以其中全部混土情况下定殖能力最强。通过对棉苗根内细菌的回收，证实拮抗细菌DM-54能在棉花根内定殖，定殖数量达103 cfu/g左右。 B.amyloliquefaciens DM-54菌株胞外分泌蛋白溶液经DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析后分离纯化到分子质量约为47 KDa的抗菌蛋白。DM-54抗菌蛋白最适作用温度为28℃，蛋白活性随着温度增加而下降。最适pH值为8.0。Cu2+则使蛋白完全失活，Mn2+对蛋白有明显的激活作用。 收起