摘要: 在动物的发育和代谢过程中，核激素受体(nuclear hormone receptor，NHR)是一种重要的调控因子。它们通过与疏水的小分子、激素、体内代谢物或外源性化合物结合来调控基因的表达过程。线虫Caenorhabditis elegans的基因组中总共包括284个核激素受体基... 展开 在动物的发育和代谢过程中，核激素受体(nuclear hormone receptor，NHR)是一种重要的调控因子。它们通过与疏水的小分子、激素、体内代谢物或外源性化合物结合来调控基因的表达过程。线虫Caenorhabditis elegans的基因组中总共包括284个核激素受体基因，其中有一些基因与脊椎动物、昆虫中的NHRs是同源物。C.elegans中很多的NHRs是线虫中所特有的，这些基因被称之为补充核受体，与脊椎动物的HNF4受体在起源上是同一个来源，在后生动物进化过程中有15个核激素受体在进化上是保守的。 本文研究的四个核激素受体分别是nhr-51、nhr-101、nhr-168和nhr-203，运用RNAi的方法发现这四种核激素受体对C.elegans野生型虫株N2和daf-16(-)、daf-2(-)突变体虫株的寿命有一定程度的影响。野生型N2和daf-2(-)突变体在nhr-51RNAi后较对照组相比平均寿命都是缩短，而daf-16(-)突变体在nhr-51干扰后与对照组相比平均寿命延长。野生型N2和daf-16(-)，daf-2(-)突变体在nhr-101RNAi后与对照组相比平均寿命都缩短。野生型N2和daf-2(-)突变体在nhr-168RNAi后平均寿命缩短，daf-16(-)突变体的寿命没有明显改变。nhr-203RNAi后三种虫株的寿命变化和nhr-51RNAi后的寿命变化结果相同。同时对DAF-16::GFP的分布也有影响，在nhr-51和nhr-203RNAi后，DAF-16::GFP在线虫的生殖腺处出现，nhr-101RNAi后在卵母细胞处出现DAF-16::GFP。 为了解C.elegans中NHR-51、NHR-101、NHR-168和NHR-203的功能，我们对C.elegans的nhr-51，nhr-101、nhr-168和nhr-203基因进行了克隆和表达鉴定。我们通过PCR对四种核激素受体的cDNA进行了扩增，获得的cDNA片段大小分别为1200bp(nhr-51)、1200bp(nhr-101)、1400bp(nhr-168)和1300bp(nhr-203)。进行了四种核激素受体基因的cDNA克隆和筛选，获得的阳性质粒进行了酶切验证和测序。将序列正确的重组质粒酶切后构建了重组表达质粒，并转化到BL21(DE3)中利用IPTG进行了诱导表达。运用SDS-PAGE凝胶电泳对表达结果进行了分析，发现重组融合蛋白分子量大小分别为44KDa(NHR-51)、40KDa(NHR-101)、50KDa(NHR-168)和44KDa(NHR-203)。进行了重组蛋白的纯化和免疫获得相应抗体。利用免疫荧光抗体染色分析了这四种核激素受体在C.elegans不同发育时期的表达情况，发现这四种核激素受体在C.elegans成虫和不同发育时期的胚胎中均有表达。NHR-51在C.elegans体内分布广泛，在成虫的口、食道、肠道、储精囊处都可以看到NHR-51的分布。在幼虫的肠道、生殖腺和食道球及咽的肌肉附近有NHR-51的分布。在胚胎中NHR-51分布于胚胎后端的细胞中，特别是在正在分裂的细胞的中心体上也有NHR-51的分布。NHR-101在成虫的神经环、肠道、生殖腺以及皮层细胞中有分布；在幼虫阶段，NHR-101分布在肠道、生殖腺和咽部。从胚胎的2细胞开始一直到胚胎发育后期，NHR-101分布在胚胎细胞质中，在部分胚胎中NHR-101分布在细胞核周围呈花环状。NHR-168在成虫肠道细胞的细胞质中、储精囊、生殖腺和尾尖处有分布；在2细胞、4细胞和8细胞胚胎中NHR-168分布在细胞核周围以及细胞质中；在多细胞胚胎中NHR-168集中分布在后端的一个细胞核的周围，呈花环状。在幼虫阶段，NHR-168分布在肠道、生殖腺和咽附近的肌肉上。NHR-203分布在成虫的肠道细胞和生殖腺中，从2细胞胚胎开始NHR-203就分布在细胞质中，并一直持续到胚胎后期。在幼虫阶段，NHR-203分布在肠道和皮层细胞处。 通过Western Blot检测发现NHR-51、NHR-101、NHR-168、NHR-203与DAF-16、DAF-2之间存在一定的相互作用；结合质谱分析技术，我们初步得到了一些和这四种核受体基因可能存在相互作用的蛋白。 收起