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国家工程技术图书馆
2022年11月29日
摘要: 异时性基因控制着整个发育过程的时间性和空间性,确定细胞的命运,从而保证各种器官的准确定位和适时发育。异时性基因发生突变,会造成整个发育过程提前或推后。在C.elegans中研究最多的异时性基因有:lin-14、lin-28、lin-41、hbl-1、lin-29、Micr... 展开 异时性基因控制着整个发育过程的时间性和空间性,确定细胞的命运,从而保证各种器官的准确定位和适时发育。异时性基因发生突变,会造成整个发育过程提前或推后。在C.elegans中研究最多的异时性基因有:lin-14、lin-28、lin-41、hbl-1、lin-29、MicroRNA lin-4和let-7等。异时性基因在调控细胞的增殖、发育及凋亡中有重要作用,在寿命调控、肿瘤发生以及其他生理病变中也起着关键的作用。本文主要通过RNAi、寿命分析、Western Blot、免疫共沉淀、质谱分析和RT-PCR等方法来研究异时性基因在寿命调控中的作用,并对脊椎动物中与肿瘤发生相关的异时性同源基因lin-28和lin-41进行了初步研究。 我们首先对各种异时性基因突变体的寿命和温度耐受性进行分析,首次发现了lin-28突变体的寿命是延长的,而let-7和lin-41突变体的寿命则是缩短的,lin-29突变体的寿命与N2相比没有明显的差异。用lin-28 RNAi长寿型虫株daf-2(-)和寿命缩短型虫株daf-16(-)观察寿命的变化。结果发现:daf-2、lin-28双突变时平均寿命与daf-2单突变相比延长。而daf-16、lin-28双突变时与daf-16单突变相比平均寿命没有显著性差异。RNA干扰lin-28后观察DAF-16::GFP荧光分布的变化,发现DAF-16::GFP的核定位并没有发生明显改变。 我们用western blot检测LIN-28在长寿虫株体内和寿命缩短虫株体内的表达,结果发现:除了lin-14突变体和lin-4、lin-14双突变之外,在包括daf-2(-)的长寿型的突变体中,LIN-28的表达含量都很低。而在包括daf-16(-)的寿命缩短型虫株体内,LIN-28的表达含量都非常高。免疫共沉淀和RNAi结果显示:LIN-28和寿命相关基因DAF-16是相互抑制的。lin-28过表达可以抑制daf-16的表达,而daf-16突变后,lin-28的表达丰度又很高。 通过免疫共沉淀和MALDI-TOF-MS质谱技术,我们初步确定了和LIN-28相互作用的几种蛋白。这些蛋白包括:T22H9.3翻译起始因子2C(eIF-2C);在线虫生殖系发育中起主要作用的P颗粒蛋白PGL-2、R13A1.10和Aff_ZK484.8。 在本次实验中,我们还研究了通过胰岛素/IGF-1途径影响寿命的异时性基因lin-14在生化水平上和daf-16的相互关系。实验研究表明,在daf-2突变的背景下,lin-14突变后,DAF-16的表达有所增加;免疫共沉淀后western blot检测实验显示lin-14和daf-16有直接的微弱相互作用;通过质谱分析方法我们初步确定了和LIN-14相互作用的四种蛋白:Y55F3C.9、R12E2.1、C50C3.7和线粒体ATP酶抑制子家族-2(mai-2)。 在脊椎动物中,我们从小鼠的第九天胚胎中成功得到了C.elegans lin-28和lin-41同源基因的部分cDNA片段,在小鼠胚胎和组织中分别通过western blot和RT-PCR检测lin-28和lin-41的表达。Western blot结果显示:LIN-28在第9天、第10.5天和第12天的胚胎中有表达,但在第9天的胚胎中表达含量较低;在成体组织的心脏和小肠中表达含量最高,其次是肾脏,在其他组织如肝脏、肌肉和脑中也有表达,但含量很低;LIN-41在小鼠胚胎第9天、第10.5和第12天有特异性的表达,而在第13天的胚胎中几乎没有表达,另外LIN-41在成体心脏、肌肉和小肠组织中有特异性表达。RT-PCR结果显示:lin-41mRNA在胚胎的第9天、第10.5天和第12天有特异性的表达;lin-28在第9天和第10.5天有特异性的表达。Co-IP和质谱的分析结果显示:与LIN-41相互作用的蛋白主要包括亮氨酸拉链转录调控因子、表皮生长因子受体、血凝素-4(Galectin-4)、线粒体和Ras相关蛋白Rab-13。 收起
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