摘要: 胰岛素是一种多生理功能蛋白质激素，在体内物质代谢中发挥极其重要的作用。胰岛素发挥生理作用的过程，大致有以下几步：(1)胰岛素与靶细胞上的胰岛素受体特异性结合；(2)胰岛素与其受体结合后发生一系列生化反应，使其生物信号得以转导和放大；... 展开 胰岛素是一种多生理功能蛋白质激素，在体内物质代谢中发挥极其重要的作用。胰岛素发挥生理作用的过程，大致有以下几步：(1)胰岛素与靶细胞上的胰岛素受体特异性结合；(2)胰岛素与其受体结合后发生一系列生化反应，使其生物信号得以转导和放大；(3)产生一系列生物效应。实际上胰岛素作用的发挥是生物信号发出、转导和实现的过程。在上述过程中、任何一个或数个环节的异常均可使胰岛素作用异常，胰岛素抵抗亦然。引起胰岛素抵抗的原因很多，大致有：(1)靶细胞内在缺陷；(2)影响靶细胞功能的继发性原因；(3)代谢因素；(4)胰岛素受体及受体后缺陷。 丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白激酶B(PKB/Akt)在控制细胞存活、葡萄糖代谢(糖原合成、糖酵解、葡萄糖摄取)及蛋白质合成等重要细胞功能中起关键作用。PKB介导的信号转导系统参与胰岛素介导的葡萄糖转运调节，而且细胞内的胰岛素抵抗机制包含PKB激活作用受损。Akt作为胰岛素受体和PI—3K和下游分子对胰岛素代谢、信号转导和葡萄糖转运起重要作用。Akt酶在胰岛素激活下的活性下降是导致GLUT4易位、葡萄糖转运损害从而产生胰岛素抵抗的一个重要的原因，但Akt激活作用受损与胰岛素抵抗是否有直接关系还存在争议。 PKB的靶蛋白即PKB的直接底物有：磷酸果糖激酶2，与糖酵解的调控有关，糖原合成激酶3(glycogen synthase kinase3，GSK3)，受PKB磷酸化后GSK3活性降低，在使糖原合成酶因磷酸化减少而活性增加，从而导致糖原合成增加。此外，GSK3与mRNA转录起动的活化也有关。研究发现2型糖尿病病人的GSK—3活性是非糖尿病者(包括肥胖非2型糖尿病者)的两倍。由于高血糖、高胰岛素血症可引起GSK—3升高，后者通过促使IRS—1丝氨酸磷酸化而抑制骨骼肌组织的胰岛素信号转导，导致进一步的葡萄糖利用障碍，最终发生2型糖尿病。PKB的另一靶标是核糖体蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase，P70S6K)，P70S6K是促进蛋白质合成的蛋白激酶，但目前不能肯定P70S6K是否直接受PKB磷酸化。 目前对PKB的研究较多，但对其下游信号GSK、P70S6K的研究较少，尤其是比较由高脂、高糖引起的胰岛素抵抗是否有一致的信号传导，目前尚未见报道。本研究拟采用高胰岛素—正血糖钳夹技术、组织病理学、免疫印记技术、放射免疫技术、RT-PCR等不同的检测方法对胰岛素抵抗大鼠的肝脏、肌肉、脂肪组织进行上述指标的检测，进一步探讨胰岛素抵抗发生的分子生物学机制。实验材料与方法： 一、实验动物 实验动物：Wistar雄性大鼠40只(中国医科大学实验动物中心提供)，4周龄，随机分为4组饲养，每组10只。即：普通饲料组、高糖饲料组、高脂饲料组、高糖高脂组。各组饮食喂养大鼠8周后，处死大鼠，采血，留取肝脏、骨骼肌、脂肪组织，速冻后，—70℃冰箱保存。 二、主要实验方法 (一)胰岛素抵抗的评估：以高胰岛素—正血糖钳夹实验，评估大鼠是否产生胰岛素抵抗并对抵抗程度进行评估 (二)血清TC、TG、HDL—C、LDL—C的测定：应用美国Abbortt Arrosset全自动生化分析仪。 (三)血清hsCRP、 FFA、INS测定：应用酶联免疫吸附法。 (四)大鼠组织AKT的表达：应用免疫组化方法。 (五)大鼠组织PI3K、GLUT4的表达：应用原位杂交方法。 (六)大鼠组织IRS—1、GSK3、P70S6K的表达：应用免疫印记方法。 (七)大鼠组织GSK3、P70S6K的表达：应用RT-PCR方法。 结果： (一)各组大鼠体重变化及附睾脂肪垫重量：体重增加最多的是G组，依次为Z组，T组，C组体重增加最少，附睾脂肪垫最重为G组，依次为Z组，T组，C组，附睾脂肪垫重量T组大于C组，但无统计学差异(P=0.02)，其它各组之间均有统计学意义。 (二)血清胰岛素检测：G组与Z组的血清胰岛素的水平明显高于C组和T组(P<0.01)，而C与T组之间、G与Z组之间无统计学差异，P分别为0.421和0.594；各组之间血糖水平无明显差异；GIR的结果：G组与Z组的GIR的水平明显低于C组和T组(P<0.01，而C与T组之间无统计学差异，P=0.194)。 (三)血清血脂系列检测：主要检测的指标是甘油三酯(Trig)、总胆固醇(Chol—C)、高密度脂蛋白(HDL—C)、低密度脂蛋白(LDL—C)。 1、G与Z组的血清Trig的含量明显高于C组(P<0.01)，G组明显高于其它三组，Z组高于T组，T组高于C组，但两组之间无统计学差异(P>0.05)；Z组高于C组，两组之间统计学差异明显(P<0.01)。 2、G与Z组的血清Chol的含量明显高于C组(P<0.01)，G组明显高于其它三组，Z组高于T组，T组高于C组，但两组之间无统计学差异(P>0.05)；Z组高于C组，两组之间统计学差异明显(P<0.01) 3、G与Z组的血清LDL—C含量均明显高于C与T组(P<0.05)，G与Z组之间无显著性差异；C与T组之间无统计学差异(P>0.05)。(3)G与Z组的血清HDL—C含量低于C与T组(P<0.05)，G与Z组之间，C与T组之间无统计学差异(P>0.05)。 4、HDL—C血清含量均明显高于C与T组(P<0.05)，G与Z组之间无显著性差异；C与T组之间无统计学差异(P>0.05)。(3)G与Z组的血清HDL—C含量低于C与T组(P<0.05)，G与Z组之间，C与T组之间无统计学差异(P>0.05)。 (四)血清游离脂肪酸(FFA)、非特异性炎症指标——超敏C反应蛋白检测： 1、 G与Z组的血清FFA含量高于C与T组(P<0.05)，G与Z组之间，C与T组之间无统计学差异(P>0.05)。 2、 G与Z组的血清hs—CRP含量高于C与T组(P<0.05)，G与Z组之间，C与T组之间无统计学差异(P>0.05)。 (五)FFA与体重、附睾脂肪垫重量、hsCRP呈明显的正相关，与GIR呈明显的负相关。GIR与体重、附睾脂肪重量、hsCRP呈明显的负相关。 (六)IRS—1、PI3K、P70S6K在胰岛素抵抗大鼠肝脏、肌肉、脂肪中的表达IRS—1、PI3K在胰岛素抵抗大鼠的肝脏、肌肉、脂肪中的表达明显低于正常大鼠，P70S6K在胰岛素抵抗大鼠的肝脏、肌肉、脂肪中的表达明显高于正常大鼠。 (七)AKT、GLUT4、GSK—3在胰岛素抵抗大鼠肝脏、肌肉、脂肪中的表达AKT、GLUT4在胰岛素抵抗大鼠的肝脏、肌肉、脂肪中的表达明显低于正常大鼠，GSK在胰岛素抵抗大鼠的肝脏、肌肉、脂肪中的表达明显高于正常大鼠。 结论： (一)高糖高脂饮食、高脂饮食饲养8周可成功的诱导Wistar大鼠产生胰岛素抵抗，单纯高糖饮食未出现胰岛素抵抗。 (二)胰岛素抵抗大鼠的体重、FINS、FFA、TC、TG、附睾脂肪垫重量、hSCRP均显著高于非胰岛素抵抗大鼠。 (三)胰岛素抵抗的形成与高水平的游离脂肪酸有关；与炎症反应有关。 (四)IRS—1、PKB、GLUT4、PI3K在胰岛素抵抗大鼠的肝脏、肌肉、脂肪中的表达减少或消失，并且减少的程度与IR程度有关。 (五)GSK—3、P70S6K在胰岛素抵抗大肝脏、肌肉、脂肪中的表达增加，与FFA正相关，与GIR呈负相关。 收起