摘要: 杆状病毒是一种重要的生物杀虫剂和基因工程的表达系统，在基因治疗中也可能发挥重要的作用。目前对杆状病毒基因组和重要基因的分子生物学已经有了一定的认识，但是病毒基因组中大部分基因仍然有待深入研究。建立一种高效的方法来研究这些功能未知的... 展开 杆状病毒是一种重要的生物杀虫剂和基因工程的表达系统，在基因治疗中也可能发挥重要的作用。目前对杆状病毒基因组和重要基因的分子生物学已经有了一定的认识，但是病毒基因组中大部分基因仍然有待深入研究。建立一种高效的方法来研究这些功能未知的基因是有重要意义的。 本文以Tn5转座子随机转座的方法构建了一个AcMNPV突变体库，大小为106。从突变库中随机选取120个克隆，抽提bacmid DNA转染Sf9细胞，得到16株与起始对照病毒表型有明显变化的突变株。应用AcMNPV全基因组上的88条引物分别与转座子上的引物配对组合，经过四轮PCR和序列分析，将16株突变株中Tn5转座子的插入位点精确定位。 从已定位的16株突变体中选择off51，orf18，p95三个功能未知的基因进行研究。为了排除突变株中可能带有的其他突变，通过同源重组的方法构建了orf51,orf18,p95缺陷的定向重组bacmid，分别为：bacGFP-△51，bacGFP-△18，bacGFP-P95in，bacGFP-P95Nd，bacGFP-△P95。研究表明orf51基因处转座子的插入导致了病毒无法复制，是AcMNPV的必需基因，同时，ORF51蛋白是BV和ODV的结构蛋白；orf18基因处转座子的插入不影响病毒的复制，是AcMNPV的非必需基因，但orfl8缺陷的病毒表达报告基因gfp的水平在Sf9和HA83l细胞中都有提高；p95基因处转座子的插入不影响病毒的复制，p95基因前段敲除也不影响病毒的复制，但p95基因全长敲除后病毒不能复制，提示着P95后段是AcMNPV复制所必需的。 本研究得到了一个AcMNPV突变体库，建立了基于AcMNPV全基因组PCR确定转座子插入位点的方法，并在定向重组Bacmid基础上对突变体orf51,orf18，p95的功能进行了初步的研究。这些为进一步高效地研究杆状病毒AcMNPV基因的功能提供 收起