摘要: 腺联病毒(adeno-associatedvirus，AAV)是很有前景的基因治疗载体。禽腺联病毒(avianadeno-associatedvirus，AAAV)具有与人AAV类似的潜伏感染特性和基因组结构。为了探索AAAV末端反向重复(ITR)和Rep基因序列能否促进外源基因的整合和表达，本研究将... 展开 腺联病毒(adeno-associatedvirus，AAV)是很有前景的基因治疗载体。禽腺联病毒(avianadeno-associatedvirus，AAAV)具有与人AAV类似的潜伏感染特性和基因组结构。为了探索AAAV末端反向重复(ITR)和Rep基因序列能否促进外源基因的整合和表达，本研究将人组织激肽释放酶(hKLKl)鸡输卵管特异表达盒克隆在AAAVITR之间，并将CMV启动子控制的Rep基因表达盒构建于同一载体，获得重组表达载体pRep2ITR-OV4-KLKl。以不含AAAV序列的鸡输卵管表达载体pOV4-KLKl为对照，通过体外释放实验确定PEI与质粒DNA的包被条件为N/P=5；用生理盐水稀释PEI-质粒DNA复合物，经翅静脉注射产蛋鸡。蛋清中重组酶的活性检测结果显示，在质粒DNA相同的条件下，pRep21TR-OV4-KLKl表达hK1的水平及维持时间较pOV4K有所提高或延长，但不能维持持久表达。这些试验结果提示，AAAVITR和(或)Rep序列能促进hKLKl在鸡输卵管上皮细胞中的表达，但不能介导外源基因的整合或整合效率很低。为了进一步研究rhKl的理化特性，对载体注射鸡蛋清进行Westernblotting检测，结果显示rhKl能被hKl特异抗体识别，成熟酶的分子量为37kDa；将鸡蛋清用不同pH的缓冲液稀释，然后进行酶活性检测，结果显示rhKl在pH7-10范围内均有较强活性；将鸡蛋清用含不同金属离子(终浓度为0.01M)的缓冲液稀释，然后进行酶活性测定，结果表明rhKl能被Cuz+、Fe3+和Al3+完全抑制；将鸡蛋清用缓冲液适当稀释，在不同温度下孵育一定时间，然后进行酶活性测定，结果显示37℃孵育20min能显著激活酶活性，而100℃孵育30min能使酶失活。为了建立hKl的定量检测方法，以饱和硫酸铵．葡萄球菌A蛋白纯化的hKl特异单克隆抗体为包被抗体，以亲和层析纯化的GST-hKl融合蛋白为抗原，建立双抗体夹心ELISA方法。在优化的反应条件下，检测已知抗原的批内和批间重复性良好，在抗原浓度在16-125μg/ml范围内具有良好的线性关系；用建立的方法对重组载体注射鸡蛋清进行检测，结果在注射载体后的第3、6、9天，蛋清中的rhKl分别为332μg/ml、476μg/ml和248μg/ml。 收起