摘要: 目的： 用基因重组技术，构建含有中国流行株HIV-1 CN54 gp120基因的重组PV载体，为HIV疫苗的进一步研究奠定基础。 方法： 采用加端PCR的方法，扩增出两端带有AatⅡ和SnaBⅠ限制性内切酶位点的gp120基因片段，经双酶切回收纯化后，将这段基... 展开 目的： 用基因重组技术，构建含有中国流行株HIV-1 CN54 gp120基因的重组PV载体，为HIV疫苗的进一步研究奠定基础。 方法： 采用加端PCR的方法，扩增出两端带有AatⅡ和SnaBⅠ限制性内切酶位点的gp120基因片段，经双酶切回收纯化后，将这段基因片段与经过双酶切消化后回收纯化的PV载体大片段进行连接。将重组子转化E.coli感受态细胞，提取质粒，进行PCR、酶切鉴定和DNA序列分析。鉴定基因重组正确的表达质粒经大量扩增纯化后，转染处于对数生长期的HeLa细胞，提取细胞总RNA，进行RT-PCR检测目的基因在mRNA水平上的表达情况；提取细胞总蛋白，进行Western-Blot分析检测目的基因在蛋白水平上的表达情况。 结论： 1.首次成功构建了包含中国主要流行株HIV-1 B'/C重组毒株CN54 gp120基因的重组PV缺陷型疫苗表达载体。 2.完成对重组PV载体的鉴定，并将其转染HeLa细胞，对目的基因在mRNA和蛋白水平的表达进行了检测。 3.对PV基因组P1区整个VP3区和部分VP2、VP1区1118～2954位处进行双酶切处理，切除1836bp的原基因片段，然后插入大片段外源性基因——1524 bp的gp120基因片段后，仍能维持基因组的翻译阅读框的稳定，转染HeLa细胞后能使外源性抗原得到表达。 4.为中国HIV候选疫苗的进一步研究如衣壳化及进一步动物实验等奠定了基础。 收起