摘要: 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一种部分双链环状嗜肝DNA病毒，是迄今为止已发现的最小的DNA病毒，约3.2Kb，含4个开放读码框(ORF)。HBV主要宿主是人类，具有高度种属和组织特异性，宿主范围狭窄。HBV可引起急慢性乙型肝炎，肝纤维化，并与原... 展开 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一种部分双链环状嗜肝DNA病毒，是迄今为止已发现的最小的DNA病毒，约3.2Kb，含4个开放读码框(ORF)。HBV主要宿主是人类，具有高度种属和组织特异性，宿主范围狭窄。HBV可引起急慢性乙型肝炎，肝纤维化，并与原发性肝细胞癌的发生发展关系密切。乙型肝炎的临床表现呈多样化，可由无症状携带者至急性肝炎、慢性肝炎、重症肝炎等，普遍认为HBV在肝细胞中增殖不会直接引起直接的肝细胞损伤，针对存在肝细胞表面的HBV抗原所引起宿主的细胞免疫应答，是肝细胞损伤的决定性因素。近来研究表明HBV的编码产物具有直接的致病作用。目前，关于HBV编码蛋白功能的研究越来越多，但多是单组分研究，HBV对宿主的整体影响尚鲜见报道。事实上，HBV感染宿主细胞后的致病性是其各编码蛋白共同作用的总体结果。本研究主要分三部分，采用新策略构建HBV肝细胞株，使HBV在HepG2细胞中不仅能长期复制、表达特异性抗原及产生病毒颗粒，而且作为模板的HBV DNA以重组DNA方式游离于细胞染色体外，同时以空载体作为对照，从而进一步研究HBV对HepG2细胞的总体影响，分析HBV的可能致病机制。 一、乙型肝炎病毒HepG2细胞株的建立以p56(AF100309)为模板，运用PCR、酶切、连接等分子生物学基本技术和方法，以pREP10为载体，经限制性核酸内切酶SalⅠ切除载体表达盒，构建1.2倍体HBV DNA重组真核表达载体，获得质粒pREP-HBV和对照质粒pRepSal；将质粒分别转染HepG2细胞，用Hygromycin筛选获得能够表达HBV特异性抗原并能够自主复制的细胞株RHBV和对照细胞株RepSal。 二、乙型肝炎病毒对HepG2细胞影响的蛋白质组学分析以RHBV-3及RepSal-1细胞株研究对象，采用双向电泳蛋白裂解液提取细胞总蛋白，并用2D蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度。将裂解并已定量的蛋白进行荧光染料Cy3/Cy5的标记，采用蛋白质组学相关技术，即荧光差异凝胶电泳(Differential in-gel electrophoresis，DIGE)分离、分析，获得RHBV-3细胞表达增高的蛋白点数为106个，降低的蛋白点数为265个，两者表达量相似的蛋白点数为2071个。进一步手工剔除不可信蛋白点，RHBV-3细胞表达增高蛋白点有35个，表达降低蛋白点有30个。切取这些差异点并进行MALDI-TOF-TOF MS分析，鉴定出50种共60个差异蛋白质，按功能可划分为：脂类代谢相关蛋白(10种)、蛋白质合成、折叠及代谢相关蛋白(10种)、细胞增殖相关蛋白(8种)、细胞骨架相关蛋白(5种)、线粒体相关蛋白(5种)、碳水化合物代谢相关蛋白(4种)及其它(8种)。 三、乙型肝炎病毒对HcpG2细胞周期的影响流式细胞仪检测发现HBV导致HepG2细胞G2/M期明显增多，且有多倍体细胞出现；激光共聚焦显微镜也观察到RHBV-3细胞中多倍体细胞明显增多；细胞生长速度明显较不含乙肝病毒的对照细胞快。为了观察蛋白酶体对细胞周期的影响，本研究采用蛋白酶体抑制剂MG132处理RepSal-1细胞，发现细胞出现G2/M期增多的现象。通过实时定量PCR进一步观察HBV对蛋白质组分析获得与细胞周期相关基因表达的影响，发现STMN1、VCP、CUL3及FBXO2表达变化与蛋白质组结果一致，均下调，YWHAE表达增高，其它基因表达未见明显变化。以上结果表明HBV可能通过蛋白酶体系统及其它周期相关蛋白影响HepG2的细胞周期，促进细胞的生长，其具体机制有待于更深入的研究。 本研究成功构建了HBV自主复制的细胞模型，并有严格的对照，首次运用蛋白质组学技术分析了HBV对HepG2细胞蛋白表达的影响，鉴定其中的差异蛋白质，分析了HBV对HepG2细胞周期的影响，更为合理地探讨HBV的致病机制。 收起