摘要: 我国是核桃的起源地之一，甘肃为我国核桃原产地域之一，种质资源十分丰富，存在许多特异种质资源。但由于长期实生繁殖，品种命名标准不一，造成品种资源底码不清，同名异物或同物异名现象严重，给核桃资源研究、保存、评价、利用及新种质的创新等带... 展开 我国是核桃的起源地之一，甘肃为我国核桃原产地域之一，种质资源十分丰富，存在许多特异种质资源。但由于长期实生繁殖，品种命名标准不一，造成品种资源底码不清，同名异物或同物异名现象严重，给核桃资源研究、保存、评价、利用及新种质的创新等带来很大困难。尽管前人利用分子标记对核桃也进行了一些研究，但利用AFLP技术对核桃进行研究的报道寥寥无几。本研究建立了较稳定的核桃AFLP反应体系，构建了69份核桃材料的指纹图谱，分析了其遗传多样性，以期为核桃品种鉴定、亲缘关系分析、高密度遗传图谱构建、核心种质构建，等奠定基础。主要研究结果如下： 1.从8种植物基因组DNA提取方法中筛选出适合核桃AFLP分析的DNA提取方法--改良CTAB法Ⅲ。采用该方法进行核桃叶片DNA的提取，方便快捷，并且能提出完全适合AFLP标记技术所需的高质量DNA。 2.通过对核桃AFLP反应体系进行系统研究，建立了适于核桃AFLP分析的最佳体系。在20μL酶切体系中，包括纯化后的基因组DNA500ng，EcoRI(NEB公司16U，MseI(NEB公司)3U，37℃水浴酶切5h；酶切后，加入5uL连接混合液，其中包括：MseI adapter(50pmol.uL-1)1.0μL，EcoRI adapter(5pmol.μL-1)1.0μL，ATP(10mmol.μL-1)1.6μL，T4DNAligase(10U.μL-1)0.13μL，T4Buffer 0.5μL，在恒温槽中16℃保温10h以上或过夜；连接完成后，将连接产物置于设定在65℃下PCR内变性10min，以去除连接酶的活性。之后，连接产物稀释20倍进行预扩增；预扩产物稀释20倍进行选择性扩增；20μL预扩增和选择性扩增体系中包括：稀释后模板DNA 5μL，TaqDNApolymerase(5U.μL-1)0.3μL，MgCl2(25mM)1.2μL，MseIprimer(50ng.uL-11.2μL，EcoRI primer(50ng.μL-1)1.2U。选择扩增产物加入10μL LoadingBuffer，95℃变性10min后，在6％变性聚丙烯酞胺凝胶上进行电泳分析；银染法检测PCR产物。 3.从81对引物组合中选出8对谱带较清晰、多态性较高的引物组合，对69份供试样品进行扩增分析，共扩增出438条电泳谱带，其中399条为多态性带，多态性比率为91.10％。 4.使用NTSYSpc-2.10e软件，利用L/PGMA法对供试材料进行聚类，建立了69份甘肃地方核桃资源的AFLP聚类图。对其遗传多样性进行了分析，揭示了甘肃地方核桃资源间遗传背景的相似性及复杂性。进一步证明了甘肃为我国核桃原产地域之一。 收起